小鼠感染模型建立
建立肠道沙门氏菌感染模型，用于研究肠上皮细胞的早期反应。
对 C57BL/6J 小鼠进行 5×10^8 CFU 鼠伤寒沙门氏菌 SL1344（GFP/RFP 标记）灌胃感染，并在感染后 0、12、24 小时收集小肠上皮细胞。
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肠干细胞中炎症小体驱动的分化程序可防御沙门氏菌感染
An inflammasome-driven differentiation program in intestinal stem cells protects against Salmonella infection
实验完整度
高结合体内小鼠感染模型、scRNA-seq、谱系示踪、类器官及基因敲除等多层级验证，明确功能与机制。
主要模型
C57BL/6J小鼠 Lgr5+肠干细胞 小鼠肠道类器官 人肠道类器官
重点核对
小鼠感染剂量：5×10^8 CFU 鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 灌胃 细胞感染 MOI：10，感染 2 小时，庆大霉素处理 30 分钟清除胞外菌 时间点：感染后 12、24、72、144 小时 Pycard 缺失模型：Lgr5-CreERT2 或 Vil1-CreERT2 介导的条件性敲除 检测指标：Lgr5+ ISC 与潘氏细胞比例、隐窝 CFU、器官oid形成能力
摘要
肠干细胞（ISC）对于维持上皮更新和屏障完整性至关重要，但它们在协调针对肠道病原体的防御中的作用仍不清楚。在此，我们确定了一种干细胞内在的免疫机制，通过该机制，Lgr5+ ISC 能够检测胞内鼠伤寒沙门氏菌，并激活依赖炎症小体的分化程序。使用荧光标记的肠道沙门氏菌、单细胞转录组学、谱系示踪、类器官模型和遗传扰动，我们表明被入侵的 ISC 通过含有 CARD 的凋亡相关斑点样蛋白（ASC，由 Pycard 编码）介导的炎症小体信号传导，快速向富含抗微生物肽的潘氏细胞重编程。这种命运转换增强了上皮的抗微生物能力，并限制了病原体在隐窝中的持续存在。该反应具有沙门氏菌特异性，并在人肠道类器官中保守。此外，与入侵相关的转录特征在克罗恩病患者的 ISC 中富集。我们的发现揭示了 ISC 作为细菌入侵的主动传感器，并通过炎症小体信号传导启动上皮重塑，突显了干细胞可塑性作为一种前线先天免疫策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Lgr5+ 肠干细胞如何直接响应并防御肠道病原菌（如鼠伤寒沙门氏菌）的入侵？
- 核心机制
- 被沙门氏菌入侵的 Lgr5+ ISC 通过 ASC（由 Pycard 编码）介导的炎症小体信号通路，激活 Wnt、Notch 和 mTOR 信号，驱动干细胞向潘氏细胞分化，以清除病原体并增强上皮抗菌防御。
- 主要证据
- 结合体内小鼠感染、scRNA-seq、谱系示踪、类器官感染实验、Pycard 条件性敲除小鼠模型以及人肠道类器官实验，证明炎症小体激活促进 ISC 向潘氏细胞分化并限制沙门氏菌在隐窝中的持续存在。
- 研究意义
- 揭示肠干细胞作为细菌入侵主动传感器的先前未知的防御机制，为理解干细胞可塑性及炎症性肠病发病机制提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
上皮细胞单细胞转录组分析
解析感染早期肠上皮细胞组成和转录程序的动态变化。
通过流式分选 EpCAM+ 细胞并进行 10x Chromium scRNA-seq 分析，鉴定细胞类型，比较感染组与对照组的细胞比例和差异表达基因。
入侵上皮细胞鉴定与转录组分析
特异性分析被沙门氏菌入侵的上皮细胞的转录特征和细胞组成。
利用 GFP 标记的沙门氏菌，通过流式分选 EpCAM+GFP+ 细胞进行 scRNA-seq，并利用 16S rRNA 探针和 CLEM 验证细菌存在。
Lgr5+ ISC 谱系示踪
追踪 Lgr5+ ISC 及其子代在感染中的分化命运。
使用 Lgr5-CreERT2;Rosa26LSL-tdTomato 小鼠进行谱系示踪，结合 scPulse-seq 和免疫荧光分析 tdTomato+ 细胞的分化轨迹。
离体类器官感染模型
验证 ISC 对沙门氏菌的直接内在反应，排除免疫细胞影响。
分离小鼠小肠隐窝并感染沙门氏菌（MOI=10），然后培养形成类器官，通过 qPCR 和流式细胞术检测 Paneth 细胞分化。
炎症小体功能验证
验证 ASC/炎症小体在 ISC 分化中的必要性。
使用 Pycard 条件性敲除小鼠（Lgr5-CreERT2 或 Vil1-CreERT2），或在人类类器官中使用 CRISPR-Cas9 敲除 PYCARD，感染沙门氏菌后检测 Paneth 细胞分化。
体内保护效果评估
评估 ISC 特异性的炎症小体防御反应在限制细菌播散中的作用。
在 PycardΔIEC 小鼠中感染沙门氏菌 144 小时后，测量肠道隐窝和脾脏中的细菌载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 他莫昔芬 | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| Jagged-1 多肽 | Ana-Spec | AS-65155 | |
| 细菌感染 | 庆大霉素 | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞培养 | Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 |
| VX-765 | Sigma | -- | |
| 类器官培养 | IntestiCult 类器官生长培养基（人） | Stemcell | 06010 |
| IntestiCult 分化培养基（人） | Stemcell | 100-0214 | |
| 流式分析 | 抗EpCAM抗体 | BioLegend | 118218 |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 103177 | |
| 抗CD24抗体 | BioLegend | 101814 | |
| 免疫荧光 | 抗溶菌酶抗体 | Agilent | EC 3.2.1.17 |
| 抗E-钙粘蛋白抗体 | BD Biosciences | 610182 | |
| 抗Olfm4抗体 | Cell Signaling Technology | 39141 | |
| 抗Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-82 | |
| 抗裂解caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| 抗RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| TUNEL实验 | TUNEL检测试剂盒 | Abcam | ab66110 |
| smFISH | RNAScope 多通道荧光试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| 单细胞测序 | Chromium 单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | timsTOF Ultra | Bruker Daltonics | -- |
| nanoElute2 | Bruker | -- | |
| 显微镜 | LSM900 共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| Tecnai SPIRIT 透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 试剂 | TrypLE Express | Gibco | -- |
| Maxima 逆转录酶 | Life Technologies | -- | |
| Fast SYBR green 预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantiBlue | Invivogen | rep-qbs | |
| MycoBlue 支原体检测试剂盒 | Vazyme Biotech | D101-01 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染 | 感染剂量：5×10^8 CFU；感染途径：灌胃；菌株：SL1344 阅读提示：Methods - Mice infection |
| 上皮细胞分离与感染细胞分选 | 庆大霉素浓度：100 μg/ml 处理30分钟；分选标志物：EpCAM、CD45、GFP 阅读提示：Methods - Epithelial cell dissociation and crypt isolation; Fig. 1a,b |
| 离体类器官感染 | MOI=10；感染时间：2小时；庆大霉素处理：100 μg/ml 阅读提示：Methods - In vitro infection of mouse small intestine crypts; Fig. 3a |
| 谱系示踪 | 他莫昔芬剂量：2 mg/20 g体重；标记细胞：Lgr5+ ISC及其子代 阅读提示：Methods - Lineage tracing and scPulse sequencing; Fig. 2a,b |
| 炎症小体功能验证 | Pycard 敲除诱导：他莫昔芬注射5次；抑制剂：Z-VAD-FMK（20 μM）或 VX-765（30 μM） 阅读提示：Methods - Pycard deletion in intestinal epithelial cells; Fig. 4a,d,i |