患者队列研究
评估早期RA、PsA患者中脂联素-PEPITEM通路的状态
从早期关节炎队列（BEACON、NEAC）和健康对照中分离PBMC，通过RT-qPCR、流式细胞术和Western blot检测ADIPOR1/2、APPL-1、14-3-3ζ的表达，并检测血清和滑液中PEPITEM及脂联素水平。
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PEPITEM调节免疫介导的炎症性关节炎中的滑膜微环境以限制疾病
PEPITEM Regulates the Synovial Microenvironment During Immune-Mediated Inflammatory Arthritis to Limit Disease
实验完整度
高包含患者样本（PBMC、血清、滑液）、三种小鼠关节炎模型、体外迁移实验、scRNA-seq、Western blot、ELISA等多层级验证，并涉及机制（COX-2/NF-κB）。
主要模型
胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型 抗原诱导关节炎（AIA）小鼠模型 单钠尿酸盐（MSU）诱导的急性痛风性关节炎小鼠模型 患者来源的PBMC和滑液样本
重点核对
PEPITEM治疗剂量和给药途径：CIA和AIA模型中300 μg/只腹腔注射，MSU模型中3 μg/只关节内注射 治疗时机：CIA模型中分别在亚临床期（第21天）和治疗性（关节炎发作时）给药 主要检测指标：临床评分、关节厚度、CD45+白细胞浸润数量、滑膜细胞因子/趋化因子水平 机制验证：COX-2和NF-κB蛋白表达水平
摘要
目的：在此，我们研究了脂联素-PEPITEM通路在早期、未接受治疗的类风湿关节炎（RA）和银屑病关节炎（PsA）中的状态，以及PEPITEM给药在临床前模型中的治疗效果。方法：从临床怀疑关节痛和疑似炎症性关节炎的患者中分离外周血，并通过流式细胞术或Western blot进行分析。通过组织学、单细胞RNA测序、流式细胞术或多重分析评估PEPITEM治疗对小鼠炎症性关节炎的影响。结果：新诊断为RA和PsA的患者外周血单个核细胞上脂联素受体2及其下游信号转导适配蛋白APPL-1的表达显著降低，导致对脂联素和局部滑膜PEPITEM浓度的反应减弱。基于这些观察，在三种不同的炎症性关节炎动物模型中，PEPITEM治疗显著降低了关节炎严重程度、关节肿胀、白细胞浸润和滑膜中几种促炎介质（例如JE [CCL2]、RANTES、白细胞介素-16）的表达。机制上，PEPITEM治疗抑制了环氧合酶2和NF-κB信号通路。此外，PEPITEM改变了募集到关节中的白细胞亚群的组成。结论：总的来说，这些发现强调了理解脂联素-PEPITEM通路在不同免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）如RA和PsA中失调的重要性。观察到的脂联素受体表达和下游信号传导的差异提示了治疗干预的潜在靶点，以恢复该调节通路的平衡，减轻这些患者的慢性炎症和疾病进展，为其作为早期IMIDs的替代和/或联合治疗的临床使用铺平道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在早期未治疗的RA和PsA患者中，脂联素-PEPITEM通路的状态如何？PEPITEM给药在临床前关节炎模型中是否具有治疗作用及其机制？
- 核心机制
- PEPITEM治疗通过抑制COX-2和NF-κB信号通路，减轻炎症反应，并改变关节内白细胞亚群组成，促进调节性免疫细胞（如Treg）的募集，从而限制关节炎的严重程度和进展。
- 主要证据
- 来自RA和PsA患者的PBMC显示ADIPOR2和APPL-1表达降低，对脂联素反应减弱。在CIA、AIA和MSU模型中，PEPITEM治疗显著降低关节炎评分、关节肿胀、白细胞浸润和促炎介质表达。scRNA-seq显示单核/巨噬细胞趋化相关基因下调。
- 研究意义
- 该研究为PEPITEM作为RA和PsA等早期IMIDs的替代或联合治疗提供了概念验证，可能通过恢复内源性调节通路减轻慢性炎症和疾病进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外迁移实验
验证PEPITEM对Treg细胞跨内皮迁移的影响
从健康供体PBMC中分离Treg细胞，用PEPITEM（15 ng/mL）或对照处理，在TNF-α和IFN-γ激活的HUVEC单层上进行迁移实验，计算跨内皮迁移百分比。
体内关节炎模型
评估PEPITEM在多种关节炎模型中的治疗效果
在CIA、AIA和MSU模型中，在亚临床期或治疗性给予PEPITEM或对照，监测临床评分、关节厚度，并通过组织学、micro-CT、流式细胞术和ELISA评估关节炎症和损伤。
单细胞转录组分析
揭示PEPITEM对滑膜免疫细胞组成和转录状态的影响
在AIA模型炎症高峰期，从PEPITEM或对照处理的小鼠关节中分选CD45+细胞进行scRNA-Seq，分析细胞亚群和差异表达基因。
机制验证
验证PEPITEM对COX-2和NF-κB信号通路的影响
通过Western blot检测滑膜组织中COX-2和NF-κB（p65）的蛋白表达，并通过ELISA检测多种细胞因子和趋化因子的水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| PBMC分离 | Histopaque分离液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 脂联素 | Enzo Life Sciences | -- |
| PEPITEM | Cambridge Research Biochemicals Limited | -- | |
| 迁移实验 | 肿瘤坏死因子α | R&D Systems | -- |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| EasySep人CD4+CD127lowCD49-调节性T细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19232 | |
| T细胞极化 | 抗CD3抗体（OKT3） | BioLegend | -- |
| ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Ultra-LEAF抗CD28（CD28.2） | BioLegend | -- | |
| 转化生长因子β1 | R&D Systems | 7754-BH-025/CF | |
| 白细胞介素-2 | Roche | 111475208001 | |
| 流式细胞术 | 抗CD25-efluor 450（BC96） | Invitrogen | -- |
| 抗CD3-PE-Cy7（OTK3） | Invitrogen | -- | |
| 抗CD4-Alexafluor 488（SK3） | BioLegend | -- | |
| Zombie Aqua活/死染料 | BioLegend | 423101 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 抗Foxp3-PE（259D） | BioLegend | -- | |
| Ki67-BV711（350516） | BioLegend | -- | |
| 基因表达分析 | RNeasy小型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories Ltd | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 兔单克隆抗COX-2（D5H5） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 兔单克隆抗NF-κB（D14E12） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 小鼠单克隆抗β-肌动蛋白（MAB8929） | R&D Systems | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 11836153001 | |
| Pierce BSA蛋白定量试剂 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 兔单克隆抗APPL-1抗体 | Proteintech | 12639-1-AP | |
| 抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| ReBlot Plus Western blot剥离试剂盒 | Millipore | -- | |
| 质谱分析 | C18固相萃取柱 | Waters XBridge | -- |
| SCIEX QTRAP 6500液相色谱-串联质谱仪 | SCIEX | -- | |
| 动物实验 | 甲基化牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Fisher Scientific | -- | |
| 英夫利昔单抗 | -- | -- | |
| 牛II型胶原 | -- | -- | |
| 单钠尿酸盐 | Sigma-Aldrich | U2875 | |
| 组织学 | 番红固绿染色液 | Abbexa | -- |
| DPX封片剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蔡司Axio Scan.Z1扫描仪 | ZEISS | -- | |
| 蛋白提取 | 胶原酶D | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胶原酶分散酶 | Roche | -- | |
| 红细胞裂解液 | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| 溶组织梭菌胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| 流式细胞术 | 抗CD45 BV605（克隆：104） | BioLegend | -- |
| 抗CD11b BV650（克隆：M1/70） | BioLegend | -- | |
| LY6C FITC（克隆：HK1.4） | BioLegend | -- | |
| F4/80 APC-efluro（克隆：BM8） | BioLegend | -- | |
| 抗CD64 PE（克隆：X454-5/7.1） | eBiosciences | -- | |
| 抗CD11c PE-Cy7（克隆：NH418） | eBiosciences | -- | |
| LY6G APC（克隆：1A8） | BD Pharmingen | -- | |
| CountBright计数微球 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 可固定活力染料eFluor | eBioscience | -- | |
| Fortessa-X20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BriCyte E6流式细胞仪 | Mindray Bio-Medical Electronics | -- | |
| FACS Aria流式分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 兔抗adipoR1多克隆抗体（G-001-44） | Phoenix Pharmaceuticals | -- | |
| 兔抗adipoR2多克隆抗体（G-001-23） | Phoenix Pharmaceuticals | -- | |
| 山羊抗兔AF488二抗 | Invitrogen | A11034 | |
| 抗CD56 PE（克隆：5.1H11） | BioLegend | -- | |
| 抗CD14 APC（克隆：HCD14） | BioLegend | -- | |
| 抗CD4 AF700（克隆：RPA.T4） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD8 E450（克隆：OKT8） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD3 PerCPCy5.5（克隆：OKT3） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD19 PE-Cy7（克隆：HIB19） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| scRNA-Seq | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒版本3.1 | 10x Genomics | PN-1000269 |
| ELISA | 人脂联素/Acrp30 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY1605 |
| 小鼠细胞因子蛋白组学芯片试剂盒 | R&D Systems | ARY006 | |
| PGE2 ELISA试剂盒（KGE004B） | R&D Systems | -- | |
| PGD2 ELISA试剂盒（E-EL-0066） | Elabscience | -- | |
| 5-HETE ELISA试剂盒（MBS2602657） | MyBioSource | -- | |
| 12-HETE ELISA试剂盒（MBS265806） | MyBioSource | -- | |
| Synergy HT酶标仪 | BioTek | -- | |
| Multiskan GO微孔板分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集与处理 | 患者分组标准：CSA、UA、RA、PsA定义；样本量：RA n=47, PsA n=14, HC n=12等；PBMC分离方法及储存条件 阅读提示：Patients and Methods: Human samples, Isolation of peripheral blood mononuclear cells; Figure 1 legend |
| PEPITEM治疗方案 | 给药剂量：CIA和AIA模型中300 μg/只，MSU模型中3 μg/只；给药途径：腹腔注射或关节内注射；给药时机：亚临床期（第21天）或治疗性（关节炎发作时） 阅读提示：Patients and Methods: Antigen-induced arthritis, Collagen-induced arthritis, Monosodium urate-induced acute gouty arthritis; Figure 2 legend |
| 关节炎模型诱导 | 小鼠品系：C57BL/6, DBA-1, CD1；免疫抗原：mBSA (10 μg/100 μg), 牛CII (100 μg), MSU晶体 (200 μg); 佐剂：CFA；诱导时间：第0天和第21天 阅读提示：Patients and Methods: Antigen-induced arthritis, Collagen-induced arthritis, Monosodium urate-induced acute gouty arthritis |
| 疗效评估 | 临床评分标准；关节厚度测量频率；组织学评分（炎症、软骨损伤）；micro-CT骨侵蚀评分 阅读提示：Patients and Methods: Histopathological staining, Micro-computed tomography; Figure 2 and 3 legends |
| 滑膜细胞分析 | 关节消化酶：胶原酶D、DNase I、胶原酶分散酶；消化时间和温度；流式抗体组合；scRNA-Seq参数（捕获细胞数、测序平台） 阅读提示：Patients and Methods: Synovial tissue digest, Flow cytometry and cell sorting, scRNA-Seq |
| 机制验证 | Western blot检测COX-2和NF-κB的抗体和浓度；ELISA检测细胞因子/趋化因子的试剂盒；蛋白定量方法 阅读提示：Patients and Methods: Western blot, Enzyme-linked immunosorbent assay |