体外组装R0/La/misfolded RNA三元复合物
确定形成稳定三元复合物所需的组装条件
将X. laevis misfolded pre-5S rRNA与Ro60和La共孵育，通过EMSA检测复合物形成，并改变蛋白添加顺序。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Ro60和La自身抗原介导RNA伴侣作用的机制研究
Mechanistic insights into RNA chaperoning by Ro60 and La autoantigens
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、SHAPE-MaP、EMSA、MST、体外核酸酶实验及细胞学验证等多层级证据。
主要模型
X. laevis 5S rRNA及其错误折叠突变体 人源5S rRNA及其变体 人HaCaT细胞系（RO60−/−和RO60−/−;TS-Ro60）
重点核对
RNA底物：X. laevis 5S rRNA、人源5S rRNA及截短突变体 蛋白：人源Ro60、La及其截短体 结合顺序：Ro60先于La结合 使用SHAPE-MaP检测RNA结构变化 使用EMSA和MST测量结合亲和力
摘要
尽管不依赖ATP的伴侣蛋白能协助RNA折叠，但其作用机制仍不清楚。在此，我们展示了两种RNA伴侣蛋白如何协同展开错误折叠的非编码RNA（ncRNA）。环状的Ro60蛋白在其空腔内结合错误折叠ncRNA的末端，而La稳定新生成的ncRNA并协助其折叠。利用冷冻电镜解析了错误折叠RNA与Ro60和La复合物的结构，我们显示La环抱Ro60 RNP，其N端结构域在RNA 3'末端穿过Ro60空腔后与其结合，而其C端结构域则使错误折叠RNA主体中的结构不稳定。利用SHAPE-MaP，我们显示La和Ro60协同作用以展开非天然结构。由于Ro60和La结合的RNA包括ncRNA前体和带有寡聚尿苷尾的ncRNA，这种RNA伴侣机器可能广泛地识别错误折叠及其他异常的ncRNA，并协助其展开。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ro60和La如何作为不依赖ATP的RNA伴侣协同作用以展开错误折叠的非编码RNA？
- 核心机制
- Ro60通过其空腔结合错误折叠RNA的3'端并诱导构象变化，暴露单链区域；La的NTD结合3'端，CTD（特别是RRM2的α3螺旋和无序区域）与RNA主体相互作用，协同破坏弱结构元件和三向连接。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构（2.7 Å和3.1 Å）显示Ro60和La的相互作用；SHAPE-MaP显示协同增加的RNA反应性；EMSA和MST显示Ro60增强La CTD的结合亲和力。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种RNA伴侣机器的机制，该机器可能广泛参与识别和展开错误折叠的ncRNA，对理解RNA质量控制具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
解析Ro60/La/misfolded RNA复合物的三维结构
使用冷冻电镜分析三元复合物和二元复合物的结构，并比较构象变化。
RNA结构探测
检测Ro60和La结合对RNA结构的影响
使用SHAPE-MaP分析RNA在自由状态、Ro60结合、La结合和Ro60/La结合状态下的结构变化。
结合亲和力测量
量化La或其结构域与RNA的亲和力及Ro60的影响
使用EMSA和MST测量La、La NTD、La CTD及截短体与RNA的亲和力，并比较有无Ro60时的差异。
细胞内Ro60/La RNP组成分析
鉴定人细胞中Ro60/La复合物结合的RNA种类
从表达TS-Ro60的RO60−/− HaCaT细胞中纯化Ro60/La RNP，通过RNA测序分析结合RNA。
体外核酸酶抗性实验
检验La和Ro60是否保护RNA免受核酸酶降解
将RNA与La或La/Ro60组装后，加入DIS3L2或ERI1，检测RNA降解程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | SF900II培养基 | ThermoFisher Scientific | 10902104 |
| pET-28a(+)载体 | Millipore Sigma | 69864 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | L3000015 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma Aldrich | P8833 | |
| 杀稻瘟菌素S | InvivoGen | ant-bl-05 | |
| 蛋白纯化 | HiTrap肝素HP柱 | Cytiva | 17040601 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶过滤柱 | Cytiva | 28989335 | |
| His Pur Ni-NTA树脂 | Thermo Scientific | 88222 | |
| PD-10脱盐柱 | Cytiva | 17085101 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | Cytiva | 28990944 | |
| 100 kDa截留分子量Pierce蛋白浓缩管PES | VWR International | P188503 | |
| 10 kDa截留分子量Amicon超滤离心管 | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| 50 kDa截留分子量Amicon超滤离心管 | Millipore Sigma | UFC205024 | |
| RNA合成 | 含P266L突变的T7 RNA聚合酶 | Homemade | -- |
| 无机焦磷酸酶 | New England Biolabs | M0361L | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201L | |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega Corporation | N2515 | |
| p2RZ载体 | Addgene | 27644 | |
| EMSA | 聚脱氧肌苷-脱氧胞苷酸 | Millipore Sigma | P4929 |
| 超纯牛血清白蛋白 | ThermoFisher | AM2616 | |
| GelRed核酸染料 | Biotium | -- | |
| MST | Monolith Premium毛细管 | Nanotemper Technologies | MO-K025 |
| Monolith NT.115 Pico系统 | Nanotemper Technologies | -- | |
| SHAPE-MaP | 1-甲基-7-硝基靛红酐（1M7） | Tocris | 6602 |
| SuperScript II逆转录酶 | Thermo Fisher | 18084022 | |
| SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher | 18080044 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | 07960140001 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965118 |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | 100-106-500 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 | |
| RNP纯化 | MagStrep Strep-Tactin XT磁珠 | IBA | 2-4090-010 |
| D-(+)-生物素 | Sigma Aldrich | 2031 | |
| 免疫沉淀 | Protein G Dynabeads磁珠 | ThermoFisher | 10004D |
| 抗La/SSB抗体（琼脂糖偶联） | Santa Cruz Biotechnology | sc-80656 AC | |
| 免疫印迹 | NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | NP0302BOX |
| 硝酸纤维素膜 | Thermo Scientific | 88018 | |
| WesternBright ECL HRP底物 | Advansta Inc. | K-12045-D50 | |
| G:Box成像系统 | Syngene | -- | |
| Northern blot | Hybond-N+尼龙膜 | Cytiva | RPN303B |
| [γ-32P]-ATP | -- | -- | |
| RNA测序 | NextSeq 1000测序仪 | Illumina | -- |
| Dynabeads MyONE silane磁珠 | ThermoFisher | 37002D | |
| T4 RNA连接酶2（截短KQ） | New England Biolabs | M0373S | |
| T4 RNA连接酶1，高浓度 | New England Biolabs | M0437M | |
| SUPERase In核糖核酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | AM2696 | |
| 核酸酶实验 | DIS3L2（NM_152383）人重组蛋白 | Origene | TP035512M |
| ERI1蛋白 | Homemade | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil Carbon R 1.2/1.3（金300）微栅 | Quantifoil | N1-C14nAu30-01 |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Titan Krios G4冷冻电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Selectris X成像过滤器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Falcon 4 / Falcon 4i直接电子探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗La Fab片段 | Creative BioLabs | HPAB-0883-FY-F(E) | |
| 细胞培养 | Bioruptor Plus超声破碎仪 | Diagenode | B01020002 |
| RNA提取 | Glycoblue共沉淀剂 | ThermoFisher | AM9516 |
| 蛋白纯化 | cOmplete™ Mini EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore Sigma | 11836170001 |
| 蛋白表达 | 大肠杆菌DH10EMBacY细胞 | gift of Eugene Valkov | -- |
| 大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞 | Promega | L1195 | |
| 细胞培养 | Sf21昆虫细胞 | gift of Eugene Valkov | -- |
| HaCaT细胞 | Cytion | 300493 | |
| 药理学 | 1M7 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 复合物组装 | 蛋白结合顺序（Ro60先于La）、蛋白浓度、RNA类型、孵育温度和时长 阅读提示：STAR Methods - Assembly of complexes for cryo-EM; Figure 1C-D |
| 冷冻电镜结构 | 样品浓度、Fab添加、网格类型、电镜参数（如像素大小、总剂量） 阅读提示：STAR Methods - Cryo-EM sample preparation and imaging; Table S1 |
| SHAPE-MaP | RNA-蛋白复合物浓度、修饰剂（1M7/2A3）浓度、孵育时间、温度 阅读提示：STAR Methods - SHAPE-MaP; Figure 5 |
| EMSA | RNA浓度、蛋白浓度范围、盐浓度、孵育条件、凝胶电泳参数 阅读提示：STAR Methods - Electrophoretic mobility shift assays; Figure 4 |
| MST | RNA浓度、蛋白浓度范围、缓冲液组成（如Tween 20浓度）、温度 阅读提示：STAR Methods - Microscale thermophoresis (MST) |
| RNP纯化 | 细胞系、裂解缓冲液、Strep-Tactin beads、洗脱条件、免疫沉淀抗体 阅读提示：STAR Methods - Purification of Ro60/La RNPs from HaCaT cells; Figure S5 |
| 核酸酶实验 | RNA和蛋白浓度、酶量、孵育时间、取样时间点 阅读提示：STAR Methods - Exoribonuclease assays; Figure S5K-M |