HSV-1感染小鼠HSK模型建立
建立HSK小鼠模型，用于时间过程转录组分析及后续实验。
C57BL/6小鼠角膜划痕后接种HSV-1 McKrae（5 µL，1×10^6 PFU/mL），在1、3、7、14天评估疾病进展。
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时间过程转录组分析揭示单纯疱疹性角膜炎中的PANoptosis-CCL2轴
Time-Course Transcriptomic Analysis Reveals PANoptosis-CCL2 Axis in Herpes Simplex Keratitis
实验完整度
高包含RNA-seq时间过程转录组分析、体外HCECs PANoptosis机制验证（CoIP、WB、IF）、共培养功能实验及体内HSK模型抑制实验，多个独立证据层级。
主要模型
HCECs（人角膜上皮细胞系ZQ1003） THP-1来源巨噬细胞 C57BL/6小鼠HSK模型（HSV-1 McKrae感染）
重点核对
HSV-1感染剂量：5 µL，1×10^6 PFU/mL（角膜划痕法） PANoptosis抑制剂组合：Z-VAD-FMK（50 µM）、Necrostatin-1（20 µM）、VX-765（20 µM） Bindarit剂量：体外100 µM，体内100 mg/kg/d腹腔注射 时间点：0、1、3、7、14天（体内）；0-36小时（体外） 流式细胞术检测F4/80+CD11b+巨噬细胞浸润
摘要
目的：本研究旨在表征单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染后角膜免疫反应和程序性细胞死亡（PCD）的时间动态，并探讨PANoptosis在单纯疱疹性角膜炎（HSK）免疫反应形成中的作用。方法：通过HSV-1感染建立小鼠HSK模型，并在感染后0、1、3、7和14天对小鼠角膜进行时间过程RNA测序。使用定量实时PCR、Western blotting、免疫荧光染色、流式细胞术和共培养实验进行表型和机制分析。使用靶向PANoptosis的拮抗剂评估PCD通路，PANoptosis是一种整合了凋亡、焦亡和坏死性凋亡关键特征的细胞死亡形式。结果：RNA测序揭示了HSV-1感染后角膜中连续的免疫反应阶段：稳态破坏和转录激活（0-3天）、免疫放大（3-7天）和组织重组（7-14天）。免疫放大阶段与凋亡、焦亡和坏死性凋亡三种不同PCD通路的激活密切相关，最终导致PANoptosis。PANoptosis被确认为HSK发病机制中的核心机制，其中Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）是PANoptosome形成的关键驱动因子。此外，人角膜上皮细胞（HCECs）中的PANoptosis被证明可促进C-C基序趋化因子配体2（CCL2）的释放，增强巨噬细胞主要组织相容性复合体II类（MHC-II）和干扰素β（IFN-β）的表达及迁移。PANoptosis-CCL2/C-C基序趋化因子受体2（CCR2）轴在感染角膜中显著上调，并且可被PANoptosis抑制剂或CCL2拮抗剂Bindarit抑制。结论：本研究证明了HSK中免疫激活与PANoptosis之间的时间协调，强调PANoptosis是放大抗病毒免疫反应的关键机制。ZBP1-PANoptosome介导的PANoptosis-CCL2/CCR2轴代表了调节HSK免疫反应的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HSV-1感染后角膜免疫反应的时间动态如何，以及PANoptosis在HSK免疫反应形成中的作用机制是什么？
- 核心机制
- HSV-1感染诱导角膜上皮细胞ZBP1介导的PANoptosis，促进CCL2释放，通过CCL2/CCR2轴招募并激活巨噬细胞，增强MHC-II和IFN-β表达，放大抗病毒免疫反应。
- 主要证据
- 时间过程RNA-seq显示免疫放大阶段与PANoptosis激活相关；体外HCECs证实ZBP1-PANoptosome形成及PANoptosis效应分子激活；共培养实验显示抑制PANoptosis或CCL2降低巨噬细胞MHC-II/IFN-β表达和迁移；体内抑制PANoptosis或CCL2减少角膜巨噬细胞浸润。
- 研究意义
- 该研究揭示了角膜上皮PANoptosis作为调节巨噬细胞免疫功能的中心机制，ZBP1-PANoptosome介导的PANoptosis-CCL2/CCR2轴是调节HSK免疫反应的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
时间过程RNA测序及生物信息学分析
描绘HSV-1感染后角膜转录组的动态变化，识别免疫反应阶段和PANoptosis相关通路。
提取角膜RNA，进行RNA-seq，通过PCA、差异表达分析、时序聚类、WGCNA、GSEA、GSVA等分析免疫动态和PANoptosis活性。
HCECs中ZBP1介导的PANoptosis验证
验证HSV-1感染HCECs是否诱导ZBP1-PANoptosome形成及PANoptosis执行。
使用TEM观察PANoptosis形态，WB检测ZBP1、ASC及下游效应分子，IF共定位，CoIP验证PANoptosome组装，siRNA敲低ZBP1评估功能。
HCEC PANoptosis对巨噬细胞功能的影响
探究上皮PANoptosis是否通过释放因子调节巨噬细胞表型和迁移。
使用Transwell共培养系统，HCECs感染HSV-1后与THP-1来源巨噬细胞共培养，流式检测MHC-II和IFN-β表达，迁移实验评估趋化。
PANoptosis-CCL2轴的体内验证
验证PANoptosis-CCL2轴在HSK小鼠角膜巨噬细胞招募和活化中的作用。
HSK小鼠给予Bindarit或PANoptosis抑制剂，免疫荧光或流式检测角膜F4/80+巨噬细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | HSV-1 McKrae株 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | TargetMol Chemicals | TQ0198 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FreeZol试剂 | Vazyme | -- | |
| RNA测序 | NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| qPCR | HiScript II Q Select RT SuperMix逆转录试剂 | Vazyme | -- |
| chamQ通用SYBR qPCR试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| Y-Tec 5分钟快速封闭液 | Yoche | YWB0501 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Abbkine | BMU102-CN | |
| 免疫荧光染色 | 含DAPI封片剂 | Abcam | ab104139 |
| 碘化丙啶染色试剂盒 | Beyotime | C1008M | |
| 流式细胞术 | I型胶原酶 | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 共培养实验 | Corning Costar Transwell共培养系统 | Corning | 3450 |
| 药物处理 | Z-VAD-FMK | -- | -- |
| Necrostatin-1 | -- | -- | |
| VX-765 | -- | -- | |
| Bindarit | -- | -- | |
| 抗体 | ZBP1抗体（YN2476） | ImmunoWay Biotechnology | YN2476 |
| TMS1/ASC抗体（WL02462） | Wanleibio | WL02462 | |
| RIPK3抗体（ER1901-27） | HUABIO | ER1901-27 | |
| RIPK1抗体（HA724083） | HUABIO | HA724083 | |
| Caspase-8抗体（HA722181） | HUABIO | HA722181 | |
| GSDMD-FL抗体（ab210070） | Abcam | ab210070 | |
| N-GSDMD抗体（WL05411） | Wanleibio | WL05411 | |
| MLKL抗体（ET1601-25） | HUABIO | ET1601-25 | |
| p-MLKL抗体（ET1705-51） | HUABIO | ET1705-51 | |
| Caspase-3抗体（ET1602-39） | HUABIO | ET1602-39 | |
| Active-CASP3抗体（ET1602-47） | HUABIO | ET1602-47 | |
| p-RIPK3抗体（HA721428） | HUABIO | HA721428 | |
| CASP1/p20抗体（22915-1-AP） | Proteintech | 22915-1-AP | |
| PARP抗体（ET1608-56） | HUABIO | ET1608-56 | |
| Cleaved-PARP抗体（ET1608-10） | HUABIO | ET1608-10 | |
| β-actin抗体（66009-1-1g） | Proteintech | 66009-1-1g | |
| 流式细胞术 | FITC-抗IFN-β抗体（BMS1044FI） | eBioscience | BMS1044FI |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠I-A/I-E (MHC-II)抗体（107625） | BioLegend | 107625 | |
| FITC-抗F4/80抗体（404-4801-80） | eBioscience | 404-4801-80 | |
| APC-抗CD11b抗体（101211） | BioLegend | 101211 | |
| 免疫荧光染色 | FITC标记二抗 | -- | -- |
| APC标记抗体 | -- | -- | |
| Western blotting | HRP标记二抗 | Proteintech | SA00001-1/2 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 细胞裂解 | Triton X-100 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST023 |
| 仪器 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA测序 | DNBSEQ-T7测序平台 | MGI Tech | -- |
| 超声破碎 | 超声破碎仪 | Covaris | -- |
| qPCR | QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光成像 | THUNDER成像系统 | Leica Microsystems | -- |
| 透射电镜 | JEOL JEM-1400透射电子显微镜 | Japan Electron Optics Laboratory | -- |
| 流式细胞术 | BD Accuri C6 Plus流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠HSK模型 | 雌性C57BL/6小鼠（6-8周龄）；HSV-1 McKrae株（1×10^6 PFU/mL，5 µL，角膜划痕3×3）；时间点0-14 dpi；临床评分和荧光素染色评分 阅读提示：Methods: Animals and HSV-1 Infection Model |
| HCECs培养和感染 | HCECs（ZQ1003）培养条件（DMEM/F-12 + 10% FBS）；HSV-1感染MOI=1，血清饥饿2小时；感染后0-24小时检测 阅读提示：Methods: Cell Culture and Viral Infection |
| PANoptosis抑制 | 抑制剂组合浓度：Z-VAD-FMK (50 µM), Necrostatin-1 (20 µM), VX-765 (20 µM)；预处理时间：2小时（体外）或滴眼（体内） 阅读提示：Methods: Co-Culture and Migration Assays, In Vivo Inhibition Experiments |
| 共培养实验 | HCECs上室，THP-1来源巨噬细胞下室；感染后6小时组装共培养，维持24小时；检测MHC-II和IFN-β表达 阅读提示：Methods: Co-Culture and Migration Assays, Figure 5F |
| CCL2抑制 | Bindarit体外浓度：100 µM；体内剂量：100 mg/kg/d腹腔注射；时间：从感染当天开始至终点 阅读提示：Methods: In Vivo Inhibition Experiments |