建立UC动物模型和细胞模型
模拟溃疡性结肠炎的体内和体外环境，用于评估维生素D的作用。
使用3% DSS诱导ICR小鼠UC模型，使用LPS诱导HCT116细胞炎症模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
维生素D通过抑制ACSL4介导的铁死亡减轻溃疡性结肠炎
Vitamin D Attenuates Ulcerative Colitis by Inhibiting ACSL4-Mediated Ferroptosis
实验完整度
高包含体内DSS诱导小鼠模型和体外LPS诱导细胞模型，并通过ACSL4过表达进行功能验证，检测炎症、氧化应激和铁死亡指标。
主要模型
DSS诱导的ICR小鼠溃疡性结肠炎模型 LPS诱导的HCT116细胞炎症模型 ACSL4过表达的HCT116细胞模型
重点核对
DSS浓度：3% DSS（MW 50,000）自由饮水10天诱导小鼠UC VD类似物CCE给药：10 μL/100 mL水，持续2周 Fer-1给药：腹腔注射1 mg/kg，每周7次，持续1周 LPS浓度：1 μg/mL处理HCT116细胞12小时 1,25(OH)2D3浓度：2×10−8 M处理细胞24小时
摘要
背景：随着环境和生活方式的改变，近期的流行病学研究表明，溃疡性结肠炎（UC）的患病率呈上升趋势，而治疗选择有限。迫切需要探索维生素D（VD）作为有效治疗的潜在机制。方法：采用葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠和脂多糖诱导的HCT116细胞分别建立体内和体外的经典UC模型。通过Western blot、免疫组化、RT-PCR及相关试剂盒分析炎症（IL-6、COX-2）、氧化应激（MDA、MPO、GSH）和铁死亡（ACSL4、GPX4、SLC7A11和铁）的典型标志物。通过Western blot、MDA和MPO方法检测转染ACSL4+/+质粒的细胞的炎症因子和氧化应激损伤。结果：与模型组相比，维生素D降低了DSS+VD和LPS+VD组中COX-2、IL-6、铁、MDA和MPO的水平，并改善了SOD1和GSH的含量。Ferrostatin-1（Fer-1）可降低DSS+Fer-1和LPS+Fer-1组中COX-2、IL-6、铁、MDA和MPO的水平，同时增加SOD1和GSH的含量，与模型组相比。VD在组织和细胞中下调ACSL4的表达并上调GPX4。转染ACSL4+/+质粒后，我们发现VD下调炎症和氧化应激的作用被缓解。结论：维生素D可通过负调控ACSL4抑制铁死亡，从而在小鼠和细胞中缓解UC，为VD治疗UC提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 维生素D是否通过抑制ACSL4介导的铁死亡来减轻溃疡性结肠炎？
- 核心机制
- 维生素D通过下调ACSL4蛋白表达抑制铁死亡，从而减轻溃疡性结肠炎的炎症和氧化应激损伤。
- 主要证据
- 在DSS诱导的小鼠和LPS诱导的HCT116细胞模型中，VD降低ACSL4表达、升高GPX4，并减少铁含量、增加GSH；ACSL4过表达逆转了VD的抗炎和抗氧化作用。
- 研究意义
- 揭示了VD通过调控ACSL4抑制铁死亡治疗UC的新机制，为VD治疗UC提供了新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估疾病严重程度
量化结肠炎症状和组织损伤，以评估VD对疾病进程的影响。
通过DAI评分、CMDI评分、HE染色评估小鼠结肠炎的严重程度和组织病理变化。
检测炎症和氧化应激指标
评估炎症和氧化应激水平，以确定VD的抗炎和抗氧化作用。
通过Western blot、RT-PCR、试剂盒检测炎症因子（COX-2、IL-6）、氧化应激标志物（MDA、MPO、SOD1、GSH）的表达水平。
检测铁死亡相关指标
确定铁死亡是否参与UC病理过程，并评估VD对铁死亡的影响。
检测铁含量、GSH水平以及ACSL4、GPX4、SLC7A11的表达。
验证铁死亡抑制剂Fer-1的作用
通过铁死亡抑制剂验证铁死亡在UC中的因果作用，并作为阳性对照。
给予Fer-1处理，比较炎症、氧化应激和铁死亡指标的变化。
ACSL4过表达功能验证
验证ACSL4在VD抑制铁死亡和减轻UC中的关键作用。
在HCT116细胞中过表达ACSL4，观察VD的抗炎和抗氧化作用是否被抵消。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型诱导 | 葡聚糖硫酸钠 | RHAWN | R051515, 50,000 MW |
| 动物及细胞药物处理 | 胆钙化醇胆固醇乳剂 | -- | -- |
| Ferrostatin-1 | GLPBIO | GC10380 | |
| 细胞培养 | HCT116完全培养基 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CM-0096 |
| 细胞药物处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 1,25-二羟基维生素D3 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| 免疫组化 | 抗ACSL4抗体 | Santa Cruz | 365230 |
| 抗GPX4抗体 | Abmart | TD6701 | |
| 抗COX-2抗体 | Wanleibio | WL01750 | |
| 抗IL-6抗体 | Wanleibio | WL03074 | |
| Western blot | 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗SOD1抗体 | Wanleibio | WL01846 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠抗体 | Proteintech | SA00001-1 | |
| 抗兔IgG抗体 | Proteintech | SA00001-2 | |
| RT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Hiscript III RT SuperMix用于qPCR | Vazyme Biotech | R323-01 | |
| QuantiTect SYBR Green I试剂盒 | Vazyme Biotech | Q711-02/03 | |
| 生化检测 | GSH检测试剂盒 | Wanleibio | WLA104 |
| MDA检测试剂盒 | Wanleibio | WLA048a | |
| MPO检测试剂盒 | Nanjingjiancheng | A044-1-1 | |
| 铁检测试剂盒 | Nanjingjiancheng | A039-2-1 | |
| 统计作图 | GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | -- |
| 图像分析 | ImageJ | National Institutes of Health | -- |
| 显微镜图像获取 | Leica 2000显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | DSS浓度、分子量、给药时间、小鼠品系、性别、周龄、饲养环境 阅读提示：见2.1 Animal Treatment |
| 药物处理方案 | VD类似物CCE的配制和剂量、给药途径、给药时间；Fer-1的剂量、给药途径、给药频率和时间 阅读提示：见2.1 Animal Treatment |
| 细胞培养和药物处理 | 细胞系、培养基、培养条件、LPS浓度和处理时间、1,25(OH)2D3浓度和处理时间、Fer-1浓度和处理时间、细胞接种密度 阅读提示：见2.2 Cell Culture and Drug Treatment |
| ACSL4过表达 | 质粒构建、转染试剂、转染方法、转染效率验证 阅读提示：见2.3 ACSL4 Transfection in HCT116 |
| 组织学和免疫组化 | 组织固定、包埋、切片厚度、染色方法、抗体浓度、抗原修复条件 阅读提示：见2.6 Histopathology and Immunohistochemistry (IHC) |
| Western blot | 蛋白提取方法、上样量、电泳条件、转膜条件、抗体浓度和孵育条件 阅读提示：见2.7 Western Blot Analysis |
| RT-PCR | RNA提取方法、逆转录试剂、定量PCR条件、引物序列 阅读提示：见2.8 Real-Time PCR 和 Table 3 |
| 氧化应激和铁死亡指标检测 | 组织/细胞制备方法、试剂盒操作步骤、检测波长为说明的显色条件 阅读提示：见2.9, 2.10, 2.11 |
| 统计分析 | 统计方法、样本量、重复数、显著性水平 阅读提示：见2.12 Statistical Analysis |