体外抗增殖和抗干细胞活性评估
评估LXH-3-71对结直肠癌细胞增殖和干细胞特性的影响。
使用CCK-8法检测细胞活力，软琼脂克隆形成和肿瘤球形成实验评估干细胞性，并用流式分选CD133+CD44+细胞进行活性检测。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
分子胶通过增强DDB1与PHGDH之间的相互作用触发PHGDH降解
Molecular glue triggers degradation of PHGDH by enhancing the interaction between DDB1 and PHGDH
实验完整度
高研究涵盖体外细胞实验（CCK-8、软琼脂克隆、肿瘤球形成）、体内模型（皮下异种移植、肺转移模型）、靶点鉴定（化学探针、LC-MS/MS）、机制验证（Co-IP、MST、泛素化实验）及基于PROTAC的应用研究。
主要模型
人结直肠癌细胞系HCT-116、SW480、HCT-15等 小鼠异种移植瘤模型（HCT-116皮下和尾静脉注射） CD133+CD44+结直肠癌干细胞
重点核对
LXH-3-71处理浓度（如1、2.5、5 μmol/L）及处理时间（24、72小时） 体内给药剂量（1和3 mg/kg，腹腔注射，每日一次） PHGDH过表达和敲低细胞系（HCT-116和HCT-15） Cys281突变体（PHGDHC281S）的使用
摘要
癌症干细胞（CSCs）在肿瘤发生、增殖、转移、耐药和复发中发挥关键作用。因此，靶向CSCs已成为癌症治疗的一个有前景的途径。近年来，3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）被发现与多种癌症干细胞的调控密切相关。然而，关于能够减轻多种癌症类型干细胞性的PHGDH功能调节剂的报道有限。在本研究中，发现了一种新型的“分子胶”LXH-3-71，它能够强烈诱导PHGDH降解，从而在体外和体内调节结直肠癌细胞（CRCs）的干细胞性。值得注意的是，观察到LXH-3-71在PHGDH和DDB1-CRL E3连接酶之间形成动态嵌合体。这些发现不仅阐明了先导化合物的抗CSCs机制，而且表明PHGDH降解可能比开发PHGDH抑制剂更具可行的治疗策略。此外，化合物LXH-3-71被用作DDB1-CRL E3连接酶的新型配体，促进了靶向EGFR和CDK4降解的新型PROTAC分子的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PHGDH是否可作为调节结直肠癌干细胞性的靶点，以及化合物LXH-3-71能否通过降解PHGDH来抑制癌细胞干性？
- 核心机制
- LXH-3-71作为分子胶，与PHGDH的Cys281共价结合，增强PHGDH与DDB1-CUL4 E3连接酶的相互作用，促进PHGDH的多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而以不依赖酶活性的方式抑制结直肠癌干细胞性。
- 主要证据
- 通过化学探针和LC-MS/MS鉴定PHGDH为直接靶点；Western blot和免疫沉淀证明PHGDH降解及DDB1相互作用增强；体内异种移植和肺转移模型显示肿瘤生长和转移抑制。
- 研究意义
- 该研究揭示了先导化合物LXH-3-71的抗癌干细胞机制，表明PHGDH降解策略可能优于PHGDH抑制剂，并为开发新型PROTAC分子提供了DDB1-CRL E3连接酶配体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内抗肿瘤和抗转移评估
验证LXH-3-71在体内的抗肿瘤效果。
建立HCT-116皮下异种移植模型和尾静脉注射肺转移模型，给予LXH-3-71、5-FU或对照，监测肿瘤体积、体重、生物发光信号及组织病理学变化。
靶点鉴定
确认LXH-3-71的直接结合靶蛋白。
设计并合成活性探针（含烯酮基团）和非活性探针，进行pull-down实验，结合LC-MS/MS鉴定靶蛋白，并通过Western blot和质谱分析确认结合位点。
PHGDH降解和泛素化验证
验证LXH-3-71是否诱导PHGDH降解并探讨其机制。
通过Western blot检测PHGDH蛋白水平的变化，使用放线菌酮追踪蛋白稳定性，MG-132抑制蛋白酶体，IP实验检测泛素化水平。
PHGDH功能验证（敲低和过表达）
验证PHGDH在维持结直肠癌干细胞性中的作用。
通过shRNA敲低和过表达PHGDH，评估其对肿瘤球形成、软琼脂克隆、干细胞标志物表达和体内成瘤能力的影响。
分子胶机制验证
验证LXH-3-71促进PHGDH与DDB1相互作用并形成泛素连接酶复合物。
通过免疫沉淀和Western blot检测PHGDH-DDB1相互作用，使用DDB1敲低和MLN4924抑制DDB1-CUL4复合物，利用MST测量结合亲和力。
PROTAC应用
利用LXH-3-71作为E3连接酶配体设计PROTAC分子，降解EGFR和CDK4。
将LXH-3-71衍生物与Gefitinib或Ribociclib连接，合成PROTAC，评估其降解效率并验证通过泛素化途径。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A 培养基 | Procell | -- |
| RPMI1640 培养基 | Procell | -- | |
| DMEM 培养基 | Procell | -- | |
| MEM 培养基 | Procell | -- | |
| DMEM/F12 培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | YEASEN | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 病毒包装与细胞感染 | 聚乙烯亚胺 | YEASEN | -- |
| 聚凝胺 | YEASEN | -- | |
| 流式分选 | 人抗CD44-FITC抗体 | BD Pharmingen | -- |
| 人抗CD133-APC抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂 | Vazyme | A311-01 |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物/PMSF | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| PVDF膜 | Millipore Corp. | IPVH00010 | |
| 脱脂牛奶 | BD Difco | 232100 | |
| 抗PHGDH抗体 | Proteintech | 14719-1-AP | |
| 抗泛素抗体 | Proteintech | 10201-2-AP | |
| 抗CD44抗体 | Proteintech | 15675-1-AP | |
| 抗LGR5抗体 | Affinity | DF2816 | |
| 抗CD166抗体 | Proteintech | 21972-1-AP | |
| 抗CD133抗体 | Proteintech | 18470-1-AP | |
| 抗CDK4抗体 | Proteintech | 11026-1-AP | |
| 抗EGFR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-373746 | |
| 抗DDB1抗体 | Proteintech | 11380-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Pull-down实验 | 链霉亲和素包被的琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质表达与纯化 | HisTrap HP 镍柱 | GE Healthcare | -- |
| pET21a(+)载体 | -- | -- | |
| 酶活性检测 | PHGDH活性检测试剂盒 | BioVision | K569 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G PLUS-琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778075 |
| 微量热泳动 | NT-647-NHS染料 | NanoTemper Technologies | -- |
| DDB1蛋白 | Abcam | ab114333 | |
| RNA提取与qPCR | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | -- |
| HiScript III第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Hieff UNICON qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | -- | |
| 体内实验 | 5-氟尿嘧啶 | -- | -- |
| LXH-3-71 | -- | -- | |
| 抗Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基组成、培养环境（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods 4.1 Cell culture |
| 体外功能实验 | LXH-3-71浓度范围、处理时间、细胞接种密度（如肿瘤球实验1000个/孔） 阅读提示：Figure 1 legend; Methods 4.6 Sphere formation assay |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、年龄（6周龄）、性别（雌性）、细胞注射数量、给药途径（腹腔注射）、剂量（1和3 mg/kg）、频率（每日一次）、对照组（vehicle, 5-FU） 阅读提示：Methods 4.15 Animal study; Figure 2 legend |
| 靶点鉴定 | 化学探针结构（探针10和13）、pull-down实验条件（裂解液成分、孵育时间）、LC-MS/MS参数 阅读提示：Methods 4.8 Biotin-streptavidin affinity pull-down assay; Figure 3 legend |
| 泛素化与降解 | MG-132浓度（10 μmol/L）和处理时间、CHX浓度、PHGDH蛋白检测时间点 阅读提示：Figure 4 legend; Methods 4.7 Western blotting |
| 分子胶机制 | DDB1敲低或siRNA处理、MLN4924浓度（1 μmol/L）、MST实验条件（蛋白浓度、buffer） 阅读提示：Figure 6 legend; Methods 4.13 Microscale thermophoresis |