临床样本分析
评估热射病患者的肝损伤指标及预后关联
收集32例热射病患者和32例健康对照的血清，检测ALT、AST、TBIL水平，并根据TBIL水平分组分析生存时间。
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血红素加氧酶1介导的Kupffer细胞铁死亡启动热射病期间的肝损伤
Heme oxygenase 1-mediated ferroptosis in Kupffer cells initiates liver injury during heat stroke
实验完整度
高包含患者样本分析、小鼠模型、细胞实验、单细胞测序及基因敲除等多层级证据，并进行功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠热射病模型 Clec4f-crexHmox1flox/flox小鼠 Nlrp3基因敲除小鼠 原代Kupffer细胞及ImKC细胞系
重点核对
小鼠热射病模型建立条件：39.5 °C，65%相对湿度，核心体温达42.7–43 °C Kupffer细胞特异性敲除Hmox1的基因型：Clec4f-crexHmox1flox/flox HMOX-1抑制剂ZnPP剂量：10 mg/kg，腹腔注射，HS前24 h HMOX-1激动剂CoPP剂量：5 mg/kg，腹腔注射，HS前24 h 样本收集时间点：HS后0、6、24 h
摘要
随着全球热浪的日益普遍，热射病已成为一个突出的健康问题，导致大量的肝损伤。与其他形式的肝损伤不同，热射病引起的损伤以热细胞毒性和加剧的炎症为特征，直接导致死亡率升高。虽然临床评估已确定胆红素水平升高提示Kupffer细胞功能障碍，但其与热射病肝损伤的具体相关性仍不清楚。我们假设热射病期间Kupffer细胞铁死亡参与其中，启动IL-1β介导的炎症。通过对小鼠巨噬细胞进行单细胞RNA测序，发现了一个独特且高度易感的Kupffer细胞亚型Clec4F+/CD206+，其中血红素加氧酶1（HMOX-1）发挥关键作用。机制上，由早期生长反应因子1调节的热诱导HMOX-1介导了Kupffer细胞的铁死亡，特别是在Clec4F+/CD206+亚型（KC2）中，激活磷脂酰肌醇4-激酶β并促进PI4P产生。这一级联反应触发NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟。这些发现强调了针对HMOX-1在Kupffer细胞（尤其是Clec4F+/CD206+ KC）铁死亡中的靶向治疗的关键作用。这种方法有可能减轻炎症并缓解热射病背景下的急性肝损伤，为未来的治疗干预提供了一条有前景的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 热射病期间Kupffer细胞是否发生铁死亡及其在启动IL-1β介导的炎症和肝损伤中的作用和机制。
- 核心机制
- 热应激诱导EGR1调控HMOX-1表达，介导Kupffer细胞（特别是KC2亚型）铁死亡，激活PI4Kβ促进PI4P产生，进而触发NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟。
- 主要证据
- 通过单细胞RNA测序鉴定KC2亚型，利用Hmox1敲除小鼠、ZnPP/CoPP处理及细胞实验验证HMOX-1介导铁死亡，并证明其激活NLRP3炎症小体，促进肝损伤。
- 研究意义
- 靶向Kupffer细胞（尤其是KC2亚型）中的HMOX-1可能减轻炎症并缓解热射病相关急性肝损伤，为未来治疗干预提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠热射病模型建立与表型分析
验证热射病小鼠模型的肝损伤和Kupffer细胞变化
将小鼠置于39.5 °C、65%相对湿度的环境中诱导热射病，监测核心体温，并在恢复0、6、24 h收集样本，检测肝损伤标志物、肝组织病理和Kupffer细胞数量。
Kupffer细胞铁死亡验证
明确Kupffer细胞是否发生铁死亡及其对肝损伤的影响
使用Clodronate脂质体耗竭Kupffer细胞，观察对肝损伤和生存率的影响；检测脂质过氧化、铁含量、线粒体形态等铁死亡标志物；并用铁死亡抑制剂（VE、liproxstatin-1、DFO）预处理小鼠，观察保护效果。
单细胞RNA测序分析巨噬细胞异质性
识别对铁死亡易感的Kupffer细胞亚型
对正常和热射病不同时间点小鼠肝脏巨噬细胞进行单细胞RNA测序，聚类分析并鉴定KC1和KC2亚型，比较其基因表达和通路富集。
HMOX-1功能验证
验证HMOX-1在Kupffer细胞铁死亡和肝损伤中的作用
使用HMOX-1抑制剂ZnPP和激动剂CoPP处理小鼠，并生成Kupffer细胞特异性Hmox1敲除小鼠，观察对肝损伤、铁死亡标志物和生存率的影响。
NLRP3炎症小体激活验证
确定HMOX-1介导的铁死亡是否激活NLRP3炎症小体
通过免疫荧光、Western blot和ELISA检测NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达，并使用ZnPP、CoPP、DFO处理及基因敲除小鼠验证调控关系。
PI4Kβ和PI4P机制研究
阐明HMOX-1如何通过PI4Kβ和PI4P激活NLRP3炎症小体
在原代KC2细胞中过表达PI4P探针（OSBP-PH-GFP），检测热应激后PI4P在TGN的聚集及NLRP3共定位；使用PI4Kβ抑制剂或敲低PI4Kβ，观察对PI4P和NLRP3激活的影响。
EGR1转录调控机制研究
揭示EGR1调控Hmox1转录的机制
通过数据库预测EGR1为HMOX-1的转录因子，在ImKC中敲低Egr1观察HMOX-1表达和NLRP3激活变化；使用双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证EGR1结合Hmox1启动子区域。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 维生素E | -- | -- |
| 利普司他汀-1 | -- | -- | |
| 去铁胺 | -- | -- | |
| 锌原卟啉 | -- | -- | |
| 钴原卟啉 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| Necrostatin-1 | -- | -- | |
| 3-甲基腺嘌呤 | -- | -- | |
| z-VAD-fmk | -- | -- | |
| 双硫仑 | -- | -- | |
| Ferrostatin-1 | -- | -- | |
| 锌原卟啉 | -- | -- | |
| 钴原卟啉 | -- | -- | |
| PI-273 | -- | -- | |
| PI4Kβ抑制剂 | -- | -- | |
| 细胞处理 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 细胞分离 | Percoll | -- | -- |
| 流式分析 | PerCP Cyanine 5.5抗CD45抗体 | Biolegend | 103132 |
| PE抗CD19抗体 | -- | -- | |
| APC/Cyanine 7抗CD3抗体 | -- | -- | |
| PE/Cyanine 7抗Ly6G抗体 | -- | -- | |
| FITC抗CD11b抗体 | Abcam | ab24874 | |
| APC抗F4/80抗体 | Abcam | ab105080 | |
| AF647抗Clec4F抗体 | Biolegend | 156804 | |
| FITC抗CD206抗体 | Biolegend | 141704 | |
| PE抗HMOX-1抗体 | Abcam | ab83214 | |
| 碘化丙啶 | Beyotime | ST511 | |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11染料 | ThermoFisher | D3861 |
| 组织化学染色 | 4-HNE抗体 | -- | -- |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Clec4F抗体 | R&D | AF2784 |
| CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| HMOX-1抗体 | Abcam | ab52947 | |
| NLRP3抗体 | R&D | MAB7578 | |
| IL-1β抗体 | R&D | AF-4-1-NA | |
| NLRP3抗体（细胞用） | Abcam | ab4207 | |
| TGN46抗体 | Abcam | ab16059 | |
| PI4Kβ抗体 | SAB | 54210 | |
| EGR1抗体 | Cell Signaling Technology | 4153S | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG聚合物 | ZSGB-Bio | PV-6001 | |
| TSA间接试剂盒 | Jilin Histova | -- | |
| 生化检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| 细胞ROS检测 | MitoSOX Red染料 | Thermo | M36008 |
| 铁离子检测 | FerroOrange染料 | Dojindo | F374 |
| 脂质过氧化检测 | Liperfluo染料 | Dojindo | L248 |
| 铁含量检测 | 细胞内铁比色检测试剂盒 | Applygen | E1042 |
| qRT-PCR | RNA提取试剂 | Servicebio | G3326-15 |
| SweScript All-in-One反转录预混液 | Servicebio | G3337-100 | |
| 2× Universal Blue SYBR Green qPCR预混液 | Servicebio | G3326-15 | |
| 基因鉴定 | 小鼠直接PCR试剂盒 | Bimake | B40015 |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E08054m |
| Western blot | 总蛋白裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | TransGen | DQ111-01 | |
| HMOX-1抗体 | Abcam | ab52947 | |
| EGR1抗体 | Cell Signaling Technology | 4153S | |
| PI4Kβ抗体 | SAB | 54210 | |
| caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 细胞转染 | LIPO 8000转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | Biofroxx | 1299MG025 |
| 新霉素 | Macklin | N6063-25g | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Absin | abs50034 |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶HS检测试剂盒 | Genecopoeia | LF004 |
| 生化检测 | AST/ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| TBIL检测试剂盒 | Changchun Huili Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者纳入标准：严重热射病，入住ICU；时间：2008年10月至2019年5月；伦理批准号：Hospital Ethics [2020]-9 阅读提示：2.1节 |
| 小鼠热射病模型 | 小鼠品系：C57BL/6 WT，雄性，8–9周龄；环境温度：39.5 °C；相对湿度：65%；热射病判定标准：核心体温达42.7–43 °C或出现衰竭迹象 阅读提示：2.2节，图1F |
| Kupffer细胞耗竭 | Clodronate脂质体剂量：200 μL，尾静脉注射，HS前7天；对照：Control脂质体 阅读提示：2.2节，图1T–V |
| 铁死亡抑制剂处理 | 维生素E剂量：500 mg/kg，口服，7天；Liproxstatin-1剂量：10 mg/kg，腹腔注射，HS前2 h；DFO剂量：100 mg/kg，腹腔注射，7天 阅读提示：2.2节，补充图S2 |
| HMOX-1药理学操作 | ZnPP剂量：10 mg/kg，腹腔注射，HS前24 h；CoPP剂量：5 mg/kg，腹腔注射，HS前24 h 阅读提示：2.2节，图4A–F |
| 基因敲除小鼠 | Clec4f-crexHmox1flox/flox小鼠构建：C57BL/6J-Clec4fem1(cre)Glass/J与C57BL/6J-Hmox1em1Cflox/Cya杂交；Nlrp3敲除小鼠：B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/J 阅读提示：2.2节 |
| 细胞热应激模型 | 热应激温度：43 °C，时间：3 h；恢复温度：37 °C，时间：0、6、24 h 阅读提示：2.3节 |
| 细胞处理 | 抑制剂浓度和时间：Nec1 30 μmol/L 1 h；3-MA 100 μmol/L 1 h；z-vad-fmk 10 μmol/L 1 h；Disulfiram 30 μmol/L 1 h；Fer-1 1 μmol/L 1 h；ZnPP 4 μmol/L 12 h；CoPP 4 μmol/L 12 h；PI-273 5 μmol/L 1 h；PI4Kβ抑制剂 5 μmol/L 1 h 阅读提示：2.3节 |
| 单细胞RNA测序 | 文库构建：GEXSCOPE Single Cell RNA Library Kit；测序平台：Illumina NovaSeq 6000，150 bp双端；生信分析：CeleScope v1.1.4，Seurat v3.1.2 阅读提示：2.6节 |
| 组织学染色 | 4-HNE免疫组化：石蜡切片4 μm；Perls' Prussian Blue染色：Perls染液（2.5%亚铁氰化钾，2.5% HCl，1:1）30 min 阅读提示：2.10、2.11节 |