转录组学分析发现CDK4/6抑制剂激活先天免疫相关通路
鉴定CDK4/6抑制剂处理前列腺癌细胞后激活的信号通路。
对palbociclib处理的DU145和C4-2细胞进行RNA-seq，并进行GSEA、KEGG和GO分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CDK4/6通过改变TBK1磷酸化抑制前列腺癌中的STING信号通路
CDK4/6 Alters TBK1 Phosphorylation to Inhibit the STING Signaling Pathway in Prostate Cancer
实验完整度
高该研究包含体外细胞实验（Western blot、co-IP、GST pulldown、体外激酶实验）、体内动物模型（RM-1和C4-2异种移植瘤）以及多组学分析（RNA-seq、CUT&Tag），并进行功能验证和机制验证。
主要模型
前列腺癌细胞系C4-2、DU145、PC-3、22Rv1、LNCaP RM-1小鼠前列腺癌细胞异种移植瘤模型（C57BL/6J小鼠） C4-2人前列腺癌细胞异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 前列腺癌组织芯片
重点核对
CDK4/6抑制剂（palbociclib）的处理浓度和时间：C4-2细胞5 µmol/L或10 µmol/L，DU145细胞50 µmol/L或100 µmol/L，处理24小时 STING激动剂diABZI的给药方案：1.5 mg/kg，静脉注射，在肿瘤达到100 mm3后第1天和第4天给药 palbociclib的给药方案：100 mg/kg，口服灌胃，每周两次 关键位点突变体：TBK1 S527A/S527D、RB1 S249A/T252A等 细胞系RB1状态：DU145为RB1缺陷型，C4-2等为RB1正常型
摘要
由于“冷”肿瘤微环境和新抗原的缺乏，免疫疗法在前列腺癌患者中的疗效有限。STING-TBK1-IRF3信号轴参与先天免疫，并越来越多地被认为是癌症免疫治疗的候选靶点。在此，我们发现CDK4/6抑制剂治疗可刺激STING通路，并在前列腺癌中增强STING激动剂的抗肿瘤效果。机制上，CDK4/6在前列腺癌细胞中磷酸化TBK1的S527位点，以不依赖RB1的方式使STING信号通路失活。CDK4/6介导的RB1在S249/T252位点的磷酸化也诱导RB1与TBK1的相互作用，减少TBK1在S172位点的磷酸化，从而抑制STING通路的激活。总的来说，这项研究表明CDK4/6通过RB1依赖和RB1非依赖两种途径抑制STING通路，表明CDK4/6抑制可能是克服前列腺癌免疫抑制的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CDK4/6如何调控前列腺癌中的STING信号通路，从而影响先天性免疫？
- 核心机制
- CDK4/6通过两种新机制抑制STING信号：一是直接磷酸化TBK1的S527位点，破坏TBK1与STING的结合；二是磷酸化RB1的S249/T252位点，促进RB1与TBK1的相互作用，减少TBK1在S172的磷酸化，从而抑制STING通路激活。
- 主要证据
- 体外激酶实验证明CDK4/6可直接磷酸化TBK1 S527；co-IP和GST pulldown证明CDK4/6和RB1与TBK1的相互作用；功能实验使用siRNA/过表达和突变体（如TBK1 S527A、RB1 S249A/T252A）验证了通路影响；体内实验显示palbociclib与diABZI联合使用可抑制RM-1移植瘤生长并增加T细胞浸润。
- 研究意义
- 该研究揭示了CDK4/6抑制剂通过激活STING通路增强抗肿瘤免疫的潜在机制，为CDK4/6抑制剂联合STING激动剂治疗前列腺癌（尤其RB1缺失患者）提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CDK4/6抑制剂对STING-TBK1-IRF3通路蛋白磷酸化的影响
检测CDK4/6抑制剂是否影响STING通路关键蛋白的磷酸化。
Western blot检测palbociclib处理后各前列腺癌细胞系中pTBK1 (S172)、pSTING、pIRF3、pTBK1 (S527)等蛋白水平。
评估CDK4/6敲低和过表达对STING通路的影响
验证CDK4/6是否直接调控STING通路活性。
在前列腺癌细胞中转染siRNA敲低CDK4/CDK6或过表达CDK4，检测STING通路蛋白磷酸化、ISG15转录及IRF3与ISG15启动子结合。
验证CDK4/6与TBK1的相互作用及功能域
确定CDK4/6是否与TBK1直接结合并定位相互作用区域。
进行co-IP、质谱分析、GST pulldown实验，使用GST标记的TBK1截短体（T-1、T-2、T-3）定位结合区域。
验证CDK4/6磷酸化TBK1 S527及其功能
证明CDK4/6通过磷酸化TBK1 S527位点抑制STING通路。
体外激酶实验证明CDK4/6磷酸化TBK1；构建S527A和S527D突变体，检测与STING的结合、IRF3磷酸化、核转位及下游转录活性。
验证RB1与TBK1的相互作用及功能
探究RB1是否通过与TBK1结合抑制STING通路。
RNA-seq分析RB1敲低后的通路变化；RT-qPCR检测ISG15表达；ChIP-qPCR检测IRF3结合；co-IP和PLA验证RB1与TBK1相互作用；GST pulldown定位RB1与TBK1的结合域。
验证RB1磷酸化状态对RB1-TBK1相互作用的影响
确定CDK4/6介导的RB1磷酸化是否促进其与TBK1的结合并抑制STING通路。
使用λ磷酸酶处理、palbociclib处理、RB1磷酸化突变体（S249A/T252A、S249D/T252D）及GFP-RL竞争性肽段，检测RB1-TBK1相互作用、TBK1 S172磷酸化及STING通路激活。
体内验证CDK4/6抑制剂联合STING激动剂的抗肿瘤效果
评估palbociclib联合diABZI在体内对前列腺癌生长的抑制作用及对免疫微环境的影响。
将RM-1细胞（表达或不表达GFP-RL）皮下接种C57BL/6J小鼠，成瘤后给予palbociclib、diABZI或联合治疗；测量肿瘤体积和重量；免疫荧光检测CD3、CD4、CD8浸润；IHC检测pTBK1、pSTING、pIRF3、pRB1等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-12K培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | NEWZERUM | FBS-CP500 | |
| 青霉素链霉素混合液 | Beijing Biological Sharp | BL505A | |
| PlasmoTest支原体检测试剂盒 | InvivoGen | rep-pt1 | |
| 药物处理 | 帕博西尼盐酸盐 | Selleck | S1116 |
| diABZI STING激动剂 | Selleck | S8796 | |
| 转染 | Lipo2000转染试剂 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Accurate Biology | AG21102 |
| RNA质检 | NanoDrop2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录与qPCR | 逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11728 |
| qPCR | Evo M-MLV一步法RT-qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11732 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Servicebio | G2002 |
| Western blot | TBK1一抗 | Proteintech | 28397-1-AP |
| RB1一抗 | Proteintech | 10048-2-Ig | |
| pRB1 (S795)一抗 | Abcam | ab47474 | |
| pRB1 (S249/T252)一抗 | Thermo Fisher Scientific | 44-548G | |
| pTBK1 (S172)一抗 | Affbiotech | AF8190 | |
| pTBK1 (S527)一抗 | HUABIO | 23225 | |
| STING一抗 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| p-STING (Ser366)一抗 | Invitrogen | PA5-105674 | |
| IRF3一抗 | Proteintech | 11312-1-AP | |
| pIRF3一抗 | Proteintech | 29528-1-AP | |
| CDK4一抗 | Proteintech | 11026-1-AP | |
| CDK6一抗 | Proteintech | 14052-1-AP | |
| cGAS一抗 | Proteintech | 26416-1-AP | |
| Histone-H3一抗 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| β-微管蛋白一抗 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| GAPDH一抗 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光检测试剂 | Millipore | -- | |
| ChemiDoc XRS成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Servicebio | G4103 |
| 免疫组织化学 | pTBK1 (S172)抗体 | Affbiotech | AF8190 |
| pTBK1 (S527)抗体 | HUABIO | 23225 | |
| p-STING (Ser366)抗体 | Invitrogen | PA5-105674 | |
| pIRF3 (Ser396)抗体 | Proteintech | 29528-1-AP | |
| pRB1 S249/T252抗体 | Thermo Fisher Scientific | 44-548G | |
| pRB1 S795抗体 | Abcam | ab47474 | |
| 人前列腺癌组织芯片 | Bioaitech | M048Pr01 | |
| 免疫荧光 | IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1-AP |
| Alexa Fluor 594偶联的山羊抗兔IgG | Invitrogen | A32740 | |
| DAPI | Boster | AR1176 | |
| 蛋白质相互作用 | GST抗体 | -- | -- |
| HA抗体 | -- | -- | |
| Flag抗体 | -- | -- | |
| 谷胱甘肽-琼脂糖珠 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| GST pulldown | 考马斯亮蓝染色液 | Servicebio | G2059 |
| 体外激酶实验 | 重组CDK4蛋白 | -- | -- |
| 重组CDK6蛋白 | -- | -- | |
| 重组GST-TBK1蛋白 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、抗生素使用、培养条件（温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| 药物处理 | palbociclib处理浓度（如C4-2 5 µmol/L、DU145 50 µmol/L）和处理时间（24小时） 阅读提示：Results及Figure legends（图2A、图3等） |
| RNA-seq分析 | palbociclib处理浓度和时间、生物学重复数（3个） 阅读提示：Materials and Methods: RNA sequencing analysis |
| CUT&Tag | 细胞系（22Rv1）、palbociclib处理（5 µmol/L 24小时）、抗体（anti-IRF3） 阅读提示：Materials and Methods: Cleavage under targets and tagmentation analysis |
| Western blot | 抗体货号、稀释比例、PVDF膜规格、封闭条件、二抗孵育条件 阅读提示：Materials and Methods: Western blot analysis |
| 小鼠实验 | 小鼠品系（C57BL/6J或BALB/c裸鼠）、年龄、细胞注射数量（5×10^6）、药物剂量与给药途径（palbociclib 100 mg/kg口服每周2次；diABZI 1.5 mg/kg静脉注射第1、4天）、肿瘤体积计算方法 阅读提示：Materials and Methods: Mouse study |
| 原位杂交（PLA） | 细胞系（C4-2）、抗体（TBK1、RB1、IgG）浓度、PLA试剂盒品牌（Duolink） 阅读提示：Materials and Methods: The proximity ligation assay |