检测SARM1在心肌纤维化中的表达
探索SARM1在心肌纤维化中的表达变化。
通过GEO数据集分析SARM1在ICM和DCM患者心脏组织中的表达；在MI小鼠心脏组织中使用Western blot和免疫荧光检测SARM1表达；在TGF-β1处理的NMCFs中检测SARM1表达。
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棕榈酰化的SARM1靶向P4HA1促进胶原沉积和心肌纤维化：抗心肌纤维化的新靶点
Palmitoylated SARM1 targeting P4HA1 promotes collagen deposition and myocardial fibrosis: A new target for anti-myocardial fibrosis
实验完整度
高包含体外细胞实验（NMCFs）、体内动物模型（MI小鼠、SARM1敲入小鼠）、患者样本（GSE116250）、组学分析（Co-IP/MS）、功能验证（敲低/过表达）和机制验证（棕榈酰化位点突变、药物筛选）。
主要模型
新生儿小鼠心脏成纤维细胞（NMCFs） 心肌梗死（MI）小鼠模型 SARM1成纤维细胞特异性敲入小鼠（Sarm1fl/fl/Cre）
重点核对
MI小鼠模型中SARM1敲低（AAV9-Postn-shSarm1）对心肌纤维化的改善作用 SARM1成纤维细胞特异性敲入小鼠（Sarm1fl/fl/Cre）对细胞外基质沉积和心功能的影响 SARM1棕榈酰化位点（CYS13、CYS350）突变对成纤维细胞功能的影响 ZDHHC17介导的SARM1棕榈酰化在TGF-β1处理NMCFs中的作用 药物（BBC、selonsertib）对SARM1表达和心肌纤维化的抑制作用
摘要
心肌纤维化是心力衰竭甚至心源性猝死的严重病因。然而，心肌缺血诱导的心脏纤维化的潜在机制仍不清楚。在此，我们确定无菌α和TIR基序包含1（SARM1）的表达在缺血性心肌病、扩张型心肌病患者（GSE116250）和小鼠纤维化心脏组织中显著增加。此外，抑制或敲低SARM1可改善心肌梗死（MI）小鼠的心肌纤维化和心功能。此外，SARM1成纤维细胞特异性敲入小鼠的细胞外基质沉积增加，心功能受损。机制上，SARM1表达升高通过直接调节P4HA1促进细胞外基质沉积。值得注意的是，通过使用Click-iT反应，我们发现ZDHHC17表达增加促进SARM1的棕榈酰化水平，从而加速纤维化进程。基于SARM1的促纤维化作用，我们筛选了几种具有抗心肌纤维化活性的药物。总之，我们揭示了棕榈酰化的SARM1靶向P4HA1促进胶原沉积和心肌纤维化。抑制SARM1是治疗心肌纤维化的潜在策略。SARM1与P4HA1相互作用的位点和SARM1的棕榈酰化修饰位点可能是抗纤维化药物的活性靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARM1在心肌缺血诱导的心脏纤维化中的功能及其调控机制是什么？
- 核心机制
- SARM1通过直接与P4HA1相互作用促进细胞外基质沉积，其表达受ZDHHC17介导的棕榈酰化调控，棕榈酰化增强SARM1蛋白稳定性，进而促进纤维化。
- 主要证据
- MI小鼠和患者心脏组织SARM1表达升高；敲低SARM1减轻纤维化，过表达加重纤维化；Co-IP和免疫荧光证实SARM1与P4HA1直接相互作用；Click-iT实验证实SARM1棕榈酰化，且ZDHHC17敲低降低SARM1棕榈酰化水平；位点突变实验证实CYS13对SARM1促纤维化功能重要。
- 研究意义
- 抑制SARM1是治疗心肌纤维化的潜在策略，SARM1与P4HA1相互作用位点及棕榈酰化位点（尤其CYS13）可能成为抗纤维化药物的活性靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SARM1敲低对心肌纤维化的影响
验证SARM1敲低能否减轻心肌纤维化。
构建AAV9-Postn-shSarm1敲低病毒，尾静脉注射MI小鼠；检测心脏功能、胶原沉积、纤维化相关蛋白表达；体外使用Sh-Sarm1质粒转染NMCFs，检测细胞活力、迁移、增殖和胶原分泌。
SARM1过表达对心肌纤维化的影响
验证SARM1过表达是否加重心肌纤维化。
构建成纤维细胞特异性Sarm1敲入小鼠（Sarm1fl/fl/Cre），检测心功能和胶原沉积；体外过表达SARM1于NMCFs，检测细胞活力、迁移、增殖和胶原分泌。
SARM1调控P4HA1的机制研究
探究SARM1调控心肌纤维化的下游机制。
Co-IP/MS筛选SARM1相互作用蛋白，发现P4HA1；通过免疫荧光和Co-IP验证SARM1与P4HA1的相互作用；分子对接预测结合位点；敲低P4ha1验证其功能。
SARM1棕榈酰化修饰及功能验证
探究SARM1在心肌纤维化中表达升高的翻译后修饰机制。
预测SARM1棕榈酰化位点（CYS13、CYS350），用Click-iT反应检测TGF-β1处理后的棕榈酰化水平；使用2-BP抑制棕榈酰化，检测SARM1表达和纤维化表型；构建棕榈酰化位点突变质粒（C13S、C350S、C13S/C350S），验证其对SARM1功能的影响。
筛选介导SARM1棕榈酰化的ZDHHC酶
鉴定介导SARM1棕榈酰化的棕榈酰转移酶。
基于蛋白图谱筛选高表达的ZDHHC酶，通过siRNA敲低候选ZDHHC（3、9、16、17、21），检测SARM1蛋白表达和棕榈酰化水平，确定ZDHHC17为关键酶。
体外药物筛选及体内验证
筛选并验证靶向SARM1的抗心肌纤维化药物。
在TGF-β1处理或SARM1过表达的NMCFs中测试SARM1抑制剂（disulfiram、BBC、DSRM-3716、ZnCl2、selonsertib）对细胞活力和胶原分泌的影响；在小鼠MI模型中验证BBC和selonsertib的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | 辽宁长生生物技术有限公司 | -- |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶-EDTA | Beyotime | -- |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 药物处理 | 转化生长因子-β1 | PeproTech | -- |
| 盐酸小檗碱（BBC） | MCE | HY-18258 | |
| 双硫仑 | MCE | HY-B0240 | |
| 塞隆替尼 | MCE | HY-18938 | |
| 他莫昔芬 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| SARM1抗体 | ImmunoWay | YN2488 | |
| P4HA1抗体 | Proteintech | 66101-1-Ig | |
| I型胶原抗体 | Affinity | AF7001 | |
| III型胶原抗体 | Affinity | AF5457 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | ImmunoWay | YT5053 | |
| ZDHHC17抗体 | ImmunoWay | YN1828 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce免疫共沉淀试剂盒 | Thermo Scientific | 26149 |
| 抗SARM1抗体 | Cell Signaling Technology | D2M5I | |
| 质谱分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Dionex ultimate 3000 RSLCnano液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Click-iT反应 | Click-iT棕榈酸叠氮化物 | Thermo Scientific | C10265 |
| 生物素炔烃 | Sigma-Aldrich | 764213 | |
| Click-iT蛋白质反应缓冲液试剂盒 | Thermo Scientific | C10276 | |
| 链霉亲和素磁珠 | Cell Signaling Technology | #3419 | |
| 免疫荧光 | 抗SARM1抗体 | Bioss | bs-9001R |
| 抗P4HA1抗体 | Proteintech | 12658-1-AP | |
| 抗ZDHHC17抗体 | Bioss | bs-6628R | |
| 抗α-SMA抗体 | ImmunoWay | YT5053 | |
| 抗I型胶原抗体 | Affinity | AF7001 | |
| DAPI | Biosharp | -- | |
| 四色多重荧光免疫组化染色试剂盒 | Absin | abs50028 | |
| 胶原含量测定 | 羟脯氨酸测定试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A030-1-1 |
| 细胞转染 | 小干扰RNA | RiboBio | -- |
| 病毒构建 | AAV9-Postn-shSarm1 | 上海吉凯基因 | -- |
| 超声心动图 | Vevo2100高分辨率成像系统 | VisualSonics | -- |
| Masson染色 | Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| CCK8 | CCK8试剂盒 | Dojindo Laboratories | CK04-500T |
| 酶标仪 | 酶标仪 | SpectraMax | ABP00380 |
| EdU染色 | Cell-light EdU Apollo488体外试剂盒 | RiboBio | -- |
| 划痕实验 | 光学显微镜 | Olympus | IX51-A12PH |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Olympus | Cat #0972818 |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| ReverTra ace qPCR RT试剂盒 | TOYOBO | -- | |
| 分子对接 | AutoDock Vina软件 | -- | -- |
| PyMOL软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | MI模型：结扎左前降支冠状动脉（LAD）28天；小鼠品系、周龄、性别、体重、饲养条件；手术具体操作细节 阅读提示：Materials and methods 2.1节 |
| 药物处理 | BBC、selonsertib给药剂量（20 mg/kg）、给药方式（口服）、给药时间（MI后连续7天）；DMEM等细胞培养基成分 阅读提示：Materials and methods 2.1节 |
| 细胞培养与处理 | NMCFs分离方法、培养条件（DMEM+10%FBS+双抗，37°C，5% CO2）；TGF-β1浓度（10 ng/mL）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods 2.3节 |
| 基因敲低/过表达 | shRNA序列、siRNA序列、质粒构建方法、转染试剂和转染条件 阅读提示：Materials and methods 2.4节 |
| 体内基因操作 | AAV9-Postn-shSarm1注射剂量（2×10^11 GC vg）、注射方式（尾静脉）、注射时间（MI前1周）；Sarm1fl/fl/Cre小鼠的他莫昔芬诱导方案（40 mg/kg腹腔注射5天） 阅读提示：Materials and methods 2.2节和2.5节 |
| 纤维化评估 | Masson染色方法、羟脯氨酸测定方法、免疫荧光染色方法；抗体稀释比例、孵育条件 阅读提示：Materials and methods 2.7、2.15、2.16节 |
| 分子机制验证 | Co-IP实验条件、Click-iT反应条件（棕榈酸叠氮化物浓度100 μmol/L、孵育6小时）、ZDHHC17敲低对SARM1棕榈酰化的影响 阅读提示：Materials and methods 2.13、2.14节 |