单细胞和空间转录组图谱构建
描绘MTC治疗前后LSCC组织的细胞组成和空间分布，识别关键细胞类型。
从2例LSCC患者治疗前后获取4个新鲜样本，进行scRNA-seq和ST分析，鉴定7种主要细胞类型，通过UMAP聚类、marker基因注释和ST映射分析细胞类型。
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单细胞和空间转录组学揭示微波热化疗治疗唇癌中的抗肿瘤中性粒细胞亚群
Single-cell and spatial transcriptomics reveals an anti-tumor neutrophil subgroup in microwave thermochemotherapy-treated lip cancer
实验完整度
高包含scRNA-seq、ST、细胞轨迹分析、细胞通讯分析、IHC、mIHC、WGCNA、生存分析和深度学习模型等多种独立实验方法，并进行了临床样本验证。
主要模型
LSCC患者肿瘤组织样本 scRNA-seq的21,108个细胞 ST的4个切片 TCGA-HNSC队列 112例LSCC患者的石蜡切片
重点核对
MTC治疗次数：至少5次（半疗程） 治疗温度：41°C至43°C 化疗药物剂量：pingyangmycin 8 mg，methotrexate 10-20 mg 样本数：scRNA-seq和ST各4个样本（2例患者治疗前后） 患者分组：治疗有效与无效、复发与无复发
摘要
微波热化疗（MTC）已用于治疗唇鳞状细胞癌（LSCC），但需要更深入地了解其治疗机制和分子生物学。为此，我们使用单细胞转录组学（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）来突出肿瘤相关中性粒细胞（TANs）在肿瘤浸润免疫细胞中的关键作用及其对MTC的治疗反应。具有抗肿瘤活性（N1表型）的MNDA+ TANs在MTC中因血流灌注增加而大量浸润，这些TANs的特征是细胞毒性增强、缺氧改善和IL1B上调，通过IL1B-IL1R激活T&NK细胞和成纤维细胞。在MTC诱导的这种高度抗肿瘤免疫原性和缺氧逆转的微环境中，聚集在肿瘤前沿（TF）的成纤维细胞可通过CXCL2-CXCR2招募N1-TANs，并通过CXCL12-CXCR4清除N2-TANs（促肿瘤表型），导致N1-TANs聚集和细胞外基质（ECM）沉积。此外，我们构建了N1-TANs标记物MX2，它与LSCC患者更好的预后正相关，并利用深度学习技术从苏木精-伊红（H&E）染色图像中预测MX2的表达，以方便临床实践中的决策。总之，我们的发现表明，响应MTC形成的N1-TANs/成纤维细胞防御墙能有效对抗LSCC。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 微波热化疗（MTC）治疗唇鳞状细胞癌（LSCC）的潜在治疗机制和分子生物学是什么？
- 核心机制
- MTC通过增加血流灌注和改善缺氧，促进具有抗肿瘤活性的MNDA+ N1型肿瘤相关中性粒细胞（TANs）浸润，并通过IL1B-IL1R信号激活T&NK细胞和成纤维细胞，成纤维细胞通过CXCL2-CXCR2招募N1-TANs、通过CXCL12-CXCR4清除N2-TANs，形成N1-TANs/成纤维细胞防御墙，从而对抗LSCC。
- 主要证据
- scRNA-seq和ST分析显示MTC后N1-TANs比例增加，N2-TANs减少；MNDA+ TANs高表达细胞毒性、抗原提呈相关基因，且IL1B表达上调；成纤维细胞与N1-TANs在肿瘤前沿共定位；IHC和mIHC验证了MNDA和SLPI的表达变化；TCGA-HNSC队列中Neu_1和Neu_2浸润与更好生存相关；MX2表达与无复发相关，深度学习模型预测MX2表达具有较高准确性。
- 研究意义
- 该研究揭示了MTC治疗LSCC的免疫机制，并提出了MNDA和MX2作为预测MTC疗效的潜在生物标志物，同时开发了基于H&E图像的深度学习模型，以方便临床决策。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TME特征和细胞空间定位分析
表征MTC治疗下的肿瘤微环境（TME），特别是肿瘤前沿（TF）的细胞组成和空间分布。
通过H&E染色和ST分析定义肿瘤区域、成纤维细胞区域和肿瘤前沿，计算各细胞类型在TF的浸润评分，进行差异表达基因和GO富集分析。
T&NK细胞亚群和功能分析
评估MTC对T&NK细胞亚群、分化轨迹和功能状态的影响。
通过无监督聚类鉴定15个T&NK细胞亚群，进行拟时间分析和RNA velocity，计算共抑制、共刺激和效应/细胞毒性评分。
肿瘤相关中性粒细胞（TANs）亚群和N1/N2分型
鉴定中性粒细胞亚群，将其分类为N1（抗肿瘤）和N2（促肿瘤）表型，并分析其动态变化。
通过无监督聚类鉴定4个中性粒细胞亚群，计算N1/N2相关基因集评分，进行拟时间和RNA velocity分析，IHC和IF验证MNDA和SLPI表达。
N1和N2-TANs功能分析
揭示N1和N2-TANs在MTC下的功能差异及其对肿瘤免疫的贡献。
分析N1和N2-TANs的通路激活、配体-受体相互作用、缺氧相关基因表达、NETs形成等，结合ST分析其在TF的分布和功能。
成纤维细胞与N1-TANs互作分析
探究成纤维细胞与N1-TANs在TF区域的相互作用，揭示其抗肿瘤机制。
通过细胞通讯分析（CellChat）和空间共定位分析，发现成纤维细胞通过CXCL2-CXCR2招募N1-TANs，通过CXCL12-CXCR4清除N2-TANs，并通过COL1A1-CD44促进黏附；mIHC验证共定位。
临床标志物和深度学习模型构建
构建预测MTC疗效和预后的生物标志物，并开发基于H&E图像的深度学习模型。
通过WGCNA和ssGSEA分析筛选N1-TANs相关基因，在临床样本中进行IHC验证MX2等表达与复发/生存的关系，收集112例LSCC的H&E和IHC切片，训练FSNet模型预测MX2表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和单细胞样本制备 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞3' v3试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 空间转录组 | Visium空间组织优化玻片及试剂盒3'v1 | 10x Genomics | -- |
| Leica CM3050冷冻切片机 | Leica | -- | |
| Leica Aperio Versa8数字病理扫描仪 | Leica | -- | |
| 免疫组化 | CD11B抗体 | Proteintech | 66519-1-lg |
| SLPI抗体 | Bioss | bs-6849R | |
| MX2抗体 | Bioss | bs-10985R | |
| MNDA抗体 | Bioss | bs-17692R | |
| HCK抗体 | Bioss | bs-1438P | |
| UltraSensitive SP免疫组化试剂盒 | Maixin Biotech | KIT-9710 | |
| 多重免疫组化 | DouSP免疫组化试剂盒 | Maixin Biotech | KIT-9999 |
| Opal聚合物辣根过氧化物酶和染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| PhenoImager Fusion多光谱成像系统 | Akoya Biosciences | -- | |
| 深度学习 | NVIDIA 3090 GPU | NVIDIA | -- |
| KF-PRO-005-EX扫描仪 | KFBIO | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MTC治疗方案 | 治疗频率（每周两次），每次间隔至少3天，标准疗程10次；化疗药物：静脉注射平阳霉素8 mg，甲氨蝶呤10-20 mg溶解于15 mL生理盐水；化疗后30分钟开始微波热疗，功率45瓦，持续45分钟，维持唇部温度41-43°C。 阅读提示：Materials and methods: Inclusion criteria and treatment regimens for LSCC patients treated with MTC |
| 样本收集标准 | 纳入标准：原发性唇肿瘤，病理确诊为鳞癌，无严重系统性疾病，签署知情同意；样本获取：治疗前和治疗中（5次MTC后）活检，新鲜组织保存于含10% FBS的RPMI-1640中，冰上运输。 阅读提示：Materials and methods: Inclusion criteria for sequencing and collection of clinical samples |
| 单细胞转录组分析 | 样本数量：2例患者治疗前后共4个样本；过滤标准：双细胞去除（DoubletFinder），高线粒体含量（≥40%）和低特征数（<200）去除；归一化：SCTransform；整合：CCA；聚类参数：30个主成分，分辨率2.0，40个细胞簇。 阅读提示：Materials and methods: Dimension reduction, clustering, and cell annotation of scRNA seq |
| 空间转录组分析 | 样本数量：4个切片；数据过滤：每个spot至少200个基因，线粒体含量≥40%去除；基因表达至少10个读数且在3个以上spot表达；聚类：14个cluster；细胞类型评分：AddModuleScore。 阅读提示：Materials and methods: Spatial transcriptomics data processing |
| 免疫组化 | 组织固定：10%中性福尔马林24-48小时；抗原修复：1mM EDTA缓冲液（pH 8.0）120°C 20分钟；一抗浓度和孵育条件（4°C 12-18小时）；二抗和显色系统：UltraSensitive SP IHC Kit或DouSP IHC Kit。 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry (IHC) |
| 生存分析 | TCGA-HNSC队列数据获取和处理；ssGSEA计算细胞浸润评分；最大选择秩统计确定最佳截断值；Kaplan-Meier曲线和对数秩检验。 阅读提示：Materials and methods: Survival analysis |