检测DSV在CRC中的丰度
评估DSV在CRC患者和模型中的富集情况及其与CRC的相关性。
通过16S rDNA测序分析高脂饮食诱导的Apcmin/+小鼠肠道菌群，发现Desulfovibrio丰度升高；通过RT-qPCR和FISH检测CRC患者与健康对照粪便和结肠组织中DSV水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
普通脱硫弧菌鞭毛蛋白通过激活LRRC19/TRAF6/TAK1通路加重结直肠癌
Desulfovibrio vulgaris flagellin exacerbates colorectal cancer through activating LRRC19/TRAF6/TAK1 pathway
实验完整度
高包括体外细胞实验（增殖、迁移、侵袭、EMT标记检测）、体内异种移植和尾静脉转移模型，以及机制验证（免疫共沉淀、泛素化分析、siRNA敲低、抑制剂实验）和临床样本分析（IHC、FISH），多层级证据。
主要模型
人结直肠癌细胞系（Caco-2、HCT116、LOVO） BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 BALB/c裸鼠尾静脉注射转移模型 Apcmin/+小鼠高脂饮食模型 无菌小鼠灌胃DSV模型
重点核对
DVF浓度1000 ng/mL用于处理CRC细胞 DVF皮下注射剂量：10 μg/100 μL PBS，每日一次 HCT116细胞接种量1×10^6 cells/小鼠 siRNA敲低LRRC19序列及转染条件（Lipofectamine 3000） TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol处理
摘要
结直肠癌（CRC）的发生和进展与遗传、环境和生物因素密切相关。普通脱硫弧菌（DSV）是一种硫酸盐还原菌，在CRC患者中过度生长，提示其在癌变中可能发挥作用。然而，这种关联背后的确切机制仍未完全阐明。我们发现在高脂饮食诱导的Apcmin/+小鼠中Desulfovibrio丰富，而DSV（Desulfovibrio的一员）触发了无菌小鼠的结肠细胞增殖。此外，DSV的水平从健康个体到CRC患者逐渐升高。鞭毛是细菌的重要辅助结构，可帮助其定植并增强侵袭能力。我们发现普通脱硫弧菌鞭毛蛋白（DVF）驱动了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进了CRC异种移植瘤的生长。DVF富集了上皮间质转化（EMT）相关基因，并表现出对EMT的促进作用。机制上，DVF通过一种功能性的跨膜受体——富含亮氨酸重复序列19（LRRC19）诱导EMT。DVF与LRRC19相互作用，调节肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6的泛素化，而非TRAF2。这种相互作用驱动关键分子TAK1的泛素化，进一步增强其自身磷酸化，最终促成EMT。总之，DVF与LRRC19相互作用激活TRAF6/TAK1信号通路，从而促进CRC的EMT。这些数据为肠道菌群在CRC中的作用提供了新的视角，并确定了一个潜在的临床治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 普通脱硫弧菌鞭毛蛋白DVF是否以及如何通过影响结直肠癌细胞的EMT来促进肿瘤进展？
- 核心机制
- DVF与跨膜受体LRRC19结合，选择性地促进TRAF6的泛素化，进而促进TAK1的泛素化和自身磷酸化，激活NF-κB通路，诱导EMT，从而增强CRC细胞的迁移和侵袭能力。
- 主要证据
- 体外实验显示DVF促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导EMT标志物变化；体内异种移植模型显示DVF促进肿瘤生长并增加EMT相关蛋白表达；机制研究表明siRNA敲低LRRC19或TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol可逆转DVF诱导的EMT。
- 研究意义
- 揭示了肠道菌群通过鞭毛蛋白影响CRC的新机制，并确定LRRC19/TRAF6/TAK1通路可能作为CRC治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外评估DVF对CRC细胞功能的影响
确定DVF对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
使用CCK-8、EdU、划痕实验、Transwell和克隆形成实验检测DVF处理后的CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力。
转录组分析DVF影响的基因表达
探索DVF对CRC细胞基因表达的影响，识别相关信号通路。
对DVF处理的Caco-2细胞进行RNA测序，GSEA分析显示EMT和糖酵解相关基因富集，RT-qPCR验证糖酵解基因表达，检测葡萄糖摄取和乳酸生成。
验证DVF诱导的EMT表型
确认DVF是否诱导CRC细胞发生EMT。
通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的表达变化。
体内验证DVF对肿瘤生长和转移的影响
在体内模型中评估DVF对CRC肿瘤生长和转移的作用。
建立裸鼠皮下异种移植和尾静脉转移模型，给予DVF处理，检测肿瘤体积、重量、增殖指标（Ki67、PCNA）和EMT标志物。
分析人CRC组织样本中的标记物
验证在人类CRC中观察到的现象与模型中一致。
通过免疫组化染色检测正常、腺瘤和CRC患者组织中的EMT标记物及LRRC19、TAK1、p-TAK1表达，并分析DSV丰度与这些标记物的关联。
机制研究：LRRC19/TRAF6/TAK1通路
阐明DVF诱导EMT的分子机制。
通过siRNA敲低LRRC19、免疫共沉淀、泛素化分析、Western blot检测TRAF6/TAK1磷酸化及NF-κB通路，并使用TAK1抑制剂（5z-7-oxozeaenol）验证。
生物信息学分析TAK1与恶性肿瘤特征
探索TAK1在CRC中的临床相关性和潜在功能。
利用CancerSEA和LinkedOmics数据库分析TAK1表达与CRC恶性特征（细胞周期、增殖、血管生成等）的相关性，以及TAK1共表达基因的功能富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 改良巴尔氏培养基 | -- | -- |
| 蛋白质表达 | PSMART-I载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌BL21 (DE3) | -- | -- | |
| 细菌定量 | QIAamp DNA粪便试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 微生物组分析 | QIAamp DNA粪便小量试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| McCoy's-5A改良培养基 | -- | -- | |
| Ham's F-12K培养基 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8溶液 | GLPBIO | GK10001 |
| BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒（Alexa Fluor 488） | Beyotime | C0071S | |
| 细胞活力检测 | Hoechst 33342染料 | -- | -- |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | LABSELECT | 14341 |
| 康宁基质胶 | Corning | 356234 | |
| 代谢检测 | 葡萄糖检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法） | Jiancheng Bio | A154-1-1 |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng Bio | A019-2-1 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488二抗 | Proteintech | SA00013-2 |
| Alexa Fluor 594二抗 | Proteintech | SA00013-4 | |
| 基因沉默 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L300075 |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂 | Vazyme | -- |
| RT-qPCR | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | -- |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| PVDF膜 | Invitrogen | -- | |
| E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 磷酸化TAK1抗体 | Bioss | bs-3438R | |
| TAK1抗体 | Proteintech | 12330-2-AP | |
| LRRC19抗体 | Abcam | ab106657 | |
| NF-κB p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 磷酸化NF-κB p65抗体 | Proteintech | 82335-1-RR | |
| IκBα抗体 | Proteintech | 10268-1-AP | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Proteintech | 82349-1-RR | |
| α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 3700 | |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2179S |
| 免疫组织化学 | VECTASTAIN Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| DAB显色剂 | Dako | -- | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| PCNA抗体 | Abcam | ab18197 | |
| 动物实验 | 新霉素 | -- | -- |
| 甲硝唑 | -- | -- | |
| 万古霉素 | -- | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DSV丰度检测 | 粪便样本中DSV定量：qPCR引物序列、qPCR反应条件；FISH探针序列、杂交缓冲液组成、甲酰胺浓度、杂交温度和时间 阅读提示：Methods: Desulfovibrio vulgaris quantification; Fluorescence in situ hybridization; Figure 1 |
| 体外细胞实验 | DVF处理浓度（1000 ng/mL）、处理时间（24/48小时）；CCK-8、EdU、划痕、Transwell、克隆形成的具体操作条件和细胞密度 阅读提示：Methods: Cell culture; Wound healing assay; Cell proliferation assay; Transwell assay; Figure 2 |
| 动物模型 | Apcmin/+小鼠品系、性别、年龄、饮食配方和干预时间；异种移植模型：裸鼠品系、性别、年龄、细胞接种量、DVF给药剂量和途径；转移模型：细胞处理、注射途径、观察时间点 阅读提示：Methods: Animal experiments; Figure 4 |
| 机制验证 | LRRC19 siRNA序列、转染试剂和浓度；TRAF2/6过表达质粒来源和转染条件；免疫共沉淀抗体和条件；TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol浓度；Western blot抗体货号和稀释比例 阅读提示：Methods: Knockdown of LRRC19 using siRNA; Plasmid construction and transfection; Co-immunoprecipitation; Western blot; Figure 5 |