ceRNA网络构建与分析
基于全转录组测序数据，预测与BMPR2相关的竞争性内源RNA（ceRNA）网络，筛选关键lncRNA和miRNA。
利用前期全转录组测序数据，筛选差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA（fold change≥2, P<0.05, FDR<0.05），通过Miranda靶标预测和Pearson相关性分析构建BMPR2相关的ceRNA网络，并用Cytoscape可视化。
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LncRNA S100PBP通过吸附MiR-2285bc-BMPR2促进牛颗粒细胞增殖和类固醇激素合成
LncRNA S100PBP promotes proliferation and steroid hormone synthesis of granulosa cells by sponging MiR-2285bc-BMPR2 in bovine†
实验完整度
高包含全转录组测序、RT-qPCR、双荧光素酶报告基因、RIP、western blot、MTT、ELISA等多种体外实验验证ceRNA机制。
主要模型
牛正常卵泡颗粒细胞（体外培养） 牛囊肿卵泡颗粒细胞
重点核对
颗粒细胞分离培养条件：正常卵泡直径10-15 mm，无血清培养基 miR-2285bc mimics/抑制剂和si-lncRNA S100PBP的转染浓度20 μM，2.5 μL加入100 μL Opti-MEM 转染时间48小时 细胞接种密度：5×10^5活细胞/孔（12孔板） MTT检测：490 nm吸光度
摘要
在牛卵泡发育过程中，牛颗粒细胞的增殖影响卵泡选择、闭锁和囊肿卵泡形成。当卵巢出现囊肿卵泡时，颗粒细胞停止增殖，导致颗粒细胞层减少。在我们之前的研究中，全转录组测序显示骨形态发生蛋白受体2（BMPR2）在囊肿和正常卵泡颗粒细胞中差异表达。我们推测长链非编码RNA可能作为竞争性内源RNA靶向microRNA，进而调控BMPR2的表达和颗粒细胞的功能，从而影响卵泡发育和囊肿形成。在本研究中，结果表明长链非编码RNA S100PBP（NONBTAT011846.2）直接结合miR-2285bc，后者靶向BMPR2 3'-UTR。miR-2285bc通过下调BMPR2表达抑制颗粒细胞增殖。此外，通过小干扰RNA沉默长链非编码RNA S100PBP，并通过交叉验证研究了长链非编码RNA S100PBP通过吸附miR-2285bc调控BMPR2表达。当将长链非编码RNA S100PBP的小干扰RNA转染到颗粒细胞中时，结果显示出与转染miR-2285bc模拟物相似的分子变化。沉默长链非编码RNA S100PBP或过表达miR-2285bc改变了一些卵泡发育相关基因的表达，这可能与卵泡囊肿的发生有关。总之，我们的研究结果表明，长链非编码RNA S100PBP通过海绵miR-2285bc调控BMPR2的表达，促进颗粒细胞的增殖，抑制其凋亡，并增加卵泡类固醇激素的合成和分泌，从而促进牛卵泡发育。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 长链非编码RNA S100PBP是否通过海绵吸附miR-2285bc调控BMPR2表达，从而影响牛颗粒细胞的增殖、凋亡和类固醇激素合成？
- 核心机制
- lncRNA S100PBP作为竞争性内源RNA（ceRNA）海绵吸附miR-2285bc，从而解除miR-2285bc对BMPR2的抑制作用，上调BMPR2表达，进而促进颗粒细胞增殖、抑制凋亡并增加类固醇激素合成。
- 主要证据
- 体外实验：双荧光素酶报告基因验证lncRNA S100PBP与miR-2285bc、BMPR2 3'-UTR与miR-2285bc的直接结合；RIP实验验证AGO2介导的lncRNA S100PBP与miR-2285bc相互作用；功能实验显示miR-2285bc mimics抑制增殖、促进凋亡，si-lncRNA S100PBP模拟类似效应，miR-2285bc inhibitor可逆转si-lncRNA S100PBP的作用。
- 研究意义
- 揭示了ncRNA和ceRNA在牛卵泡发育中的调控作用，为牛卵泡发育的调控机制提供了新方向，可能为改善牛繁殖性能提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选lncRNA鉴定与表达验证
确认lncRNA S100PBP的基本特征及其在颗粒细胞中的表达和定位。
通过NONCODE数据库比对、蛋白编码潜能分析、亚细胞定位检测和RT-qPCR验证lncRNA S100PBP在正常和囊肿卵泡颗粒细胞中的差异表达。
ceRNA相互作用验证
验证lncRNA S100PBP与miR-2285bc、miR-2285bc与BMPR2 3'-UTR的直接结合关系。
采用双荧光素酶报告基因实验，构建野生型和突变型质粒，共转染miR-2285bc mimics/NC，检测荧光素酶活性；利用RIP实验验证miR-2285bc和lncRNA S100PBP与AGO2的关联。
miR-2285bc功能验证
探究miR-2285bc对牛颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素合成及囊肿相关基因表达的影响。
在颗粒细胞中转染miR-2285bc mimics或inhibitor，检测BMPR2、SMAD家族、增殖相关基因（CCND2、PCNA）、凋亡相关基因（BCL2、BAX、CASP3）、类固醇合成相关基因（CYP11A1、CYP19A1、HSD3B1、STAR）的表达，以及细胞活力（MTT）、E2和P4水平。
lncRNA S100PBP功能验证
验证lncRNA S100PBP作为ceRNA通过吸附miR-2285bc调控颗粒细胞功能，并验证miR-2285bc inhibitor的挽救作用。
用siRNA沉默lncRNA S100PBP，单独或与miR-2285bc inhibitor共转染颗粒细胞，检测BMPR2及下游基因表达、细胞活力、E2和P4水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
验证细胞功能变化
检测激素水平
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| RT-qPCR | TB Green试剂盒 | Takara | -- |
| miRNA逆转录 | M5 miRNA cDNA合成试剂盒 | Mei5 bio | -- |
| miRNA qPCR | M5 miRNA qPCR检测试剂盒 | Mei5 bio | -- |
| 核质分离 | Paris试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | MEM Alpha培养基 | Gibco | -- |
| 细胞计数 | 台盼蓝 | Solarbio | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| Mut Express II快速突变试剂盒V2 | Vazyme | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞活力检测 | MTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | BOSTER | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | BOSTER | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | BOSTER | -- | |
| BMPR2抗体 | ABclonal | A5666 | |
| CASP3抗体 | ABclonal | A2156 | |
| CASP3（活化）抗体 | Sangon | D160009 | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 山羊抗兔IgG H&L（IRDye 800CW） | LI-COR Biosciences | D10512-05 | |
| RIP | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | -- |
| 磁珠 | MCE | -- | |
| IgG抗体 | ABclonal | -- | |
| AGO2抗体 | BOSTER | -- | |
| ELISA | 牛ELISA试剂盒 | Blue gene | -- |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | -- | -- |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞转染 | LipoFilter 3.0转染试剂 | Hanbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 牛品种（海福特牛）、年龄（>2岁）、产后天数（≥45 d）、产奶量（平均21±5.5 kg/天） 阅读提示：Materials and methods - Sample collection |
| 颗粒细胞分离与培养 | 卵泡直径选择（正常10-15 mm，囊肿≥25 mm），培养基（MEM Alpha），接种密度（5×10^5细胞/孔） 阅读提示：Materials and methods - Sample collection, In vitro GC culture |
| 转染 | 转染试剂（LipoFilter 3.0），siRNA/mimics/inhibitor浓度（20 μM储备液，2.5 μL/孔），转染时间（48 h） 阅读提示：Materials and methods - GC transfection |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 质粒构建（pmirGLO），共转染miR-2285bc mimics/NC，检测时间（48 h） 阅读提示：Materials and methods - Dual-luciferase gene reporter assay |
| RT-qPCR | 内参基因（lncRNA/mRNA：ACTB, GAPDH；miRNA：miR-15a, miR-191），循环条件（40 cycles, 95°C 5 s, 60°C 30 s 或 95°C 15 s, 60°C 1 min） 阅读提示：Materials and methods - Real-time quantitative PCR |
| Western blot | 抗体信息及其稀释比例（BMPR2 1:500, CASP3 1:500, active-CASP3 1:1000, β-actin 1:10000, 二抗1:18000） 阅读提示：Materials and methods - Western blotting assay, Table 4 |
| ELISA | 试剂盒（Blue gene），检测指标（E2、P4） 阅读提示：Materials and methods - Enzyme-linked immunosorbent assay |