可溶性龙眼多糖经化学硒化共价修饰后增强对人结肠癌HT-29细胞的生长抑制和凋亡诱导作用

Enhanced Growth Inhibition and Apoptosis Induction in Human Colon Carcinoma HT-29 Cells of Soluble Longan Polysaccharides with a Covalent Chemical Selenylation

作者信息Ya-Hui Yu, Zhi-Mei Tang, Cen Xiong, Fei-Fei Wu, Jun-Ren Zhao, Xin-Huai Zhao
PMID35565676
期刊Nutrients
发布时间2022-04
DOI10.3390/nu14091710

实验完整度

高

包含细胞模型(HT-29)体外实验,涵盖细胞活力、形态、凋亡、ROS、钙离子、线粒体膜电位、基因和蛋白表达及抑制剂验证等多层级验证,且具有统计重复。

主要模型

人结肠癌HT-29细胞

重点核对

处理浓度:LP、SeLP1、SeLP2处理浓度为50–800 μg/mL 处理时间:24和48小时,及14、21天克隆形成实验 阳性对照:5-FU(100 μmol/L) 无机硒对照:Na2SeO3(1–16 μg/mL) 凋亡检测:Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术

摘要

硒化多糖在化学上属于有机硒结合的大分子,因其具有促进身体健康或预防癌症的潜力,近年来越来越受到关注。龙眼(Dimocarpus longan L.)作为一种亚热带水果,含有可溶性的、不可消化的多糖,这些多糖被认为在体内具有保健功能。在本研究中,通过酶辅助水提法获得龙眼多糖(LP),然后使用由HNO3–Na2SeO3组成的反应体系进行化学硒化,得到两种硒化产物,即SeLP1和SeLP2,其硒含量分别为1.46和4.79 g/kg。以人结肠癌HT-29细胞为细胞模型,研究了三种多糖样品(LP、SeLP1和SeLP2)的抗癌作用。结果表明,SeLP1和SeLP2比LP更能抑制细胞生长、改变细胞形态、引起线粒体膜电位丧失、增加细胞内活性氧和[Ca2+]i水平,并通过调节包括Bax、caspases-3/-8/-9、CHOP、cytochrome c、DR5和Bcl-2在内的八个凋亡相关基因和蛋白来诱导细胞凋亡。由此证明,硒化多糖可以通过激活死亡受体、线粒体依赖性和内质网应激通路诱导细胞凋亡。总的来说,SeLP1和SeLP2在HT-29细胞中均表现出高于LP的活性,而SeLP2在发挥这些评估的抗癌作用方面始终比SeLP1更活跃。总之,这种化学硒化通过共价将Se引入多糖分子中,并增强了它们在细胞中的抗癌功能,而更高的硒化程度有利于硒化产物活性的增强。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
化学硒化修饰龙眼多糖是否影响其抗结肠癌活性,以及硒化程度是否决定硒化多糖的抗癌活性。
核心机制
硒化多糖通过激活死亡受体、线粒体依赖和ER应激三条凋亡通路诱导HT-29细胞凋亡。
主要证据
MTT实验、Hoechst染色、克隆形成、流式细胞术、RT-qPCR和Western blot等实验表明,SeLP1和SeLP2比LP更能抑制细胞生长、诱导凋亡,且SeLP2活性更强。
研究意义
化学硒化可作为一种增强多糖抗癌功能的策略,并鼓励开发富硒食品成分;同时需要进一步研究硒化LP的体内抗结肠癌潜力及其结构特征,以揭示构效关系。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

多糖提取与硒化

获得龙眼多糖并进行化学硒化,制备不同硒含量的硒化多糖。

采用酶辅助水提法提取LP,并用HNO3–Na2SeO3反应体系制备SeLP1和SeLP2。

2

细胞活性测定

评估多糖样品对HT-29细胞增殖的抑制作用。

用MTT法检测不同浓度和处理时间下的细胞活力。

3

细胞形态观察

观察处理后的细胞形态变化。

用Hoechst 33258染色观察细胞核形态。

4

克隆形成实验

评估长期增殖抑制效果。

细胞处理48h后继续培养14或21天,染色计数。

5

凋亡相关指标检测

检测ROS、Ca2+和线粒体膜电位变化,评估凋亡诱导。

使用荧光探针JC-1、DCFH-DA和Fura-2 AM分别检测MMP、ROS和Ca2+。

6

流式细胞术检测凋亡

定量分析细胞凋亡率。

Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞仪检测。

7

基因表达检测

检测凋亡相关基因mRNA表达水平。

RT-qPCR检测Bax、Bcl-2等8个基因表达。

8

蛋白表达检测

检测凋亡相关蛋白表达水平,并验证caspase-3作用。

Western blot检测蛋白表达,并用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
McCoy's 5A培养基Sigma-Aldrich--
胎牛血清Wisent Inc.--
MTT试剂Sigma-Aldrich--
5-氟尿嘧啶Aladdin--
果胶酶Aladdin--
纤维素酶Solarbio--
磷酸盐缓冲液Solarbio--
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime--
Fura-2 AM荧光探针Beyotime--
二甲基亚砜Beyotime67-68-5
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒Beyotime--
Hoechst 33258荧光染料Beyotime--
caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHOBeyotime--
活性氧检测试剂盒Beyotime--
结晶紫染色液Beyotime--
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)Beyotime--
RNAprep Pure细胞细菌RNA提取试剂盒Tiangen--
NovoScript®两步法RT-PCR试剂盒Novoprotein--
SYBR qPCR SuperMix PlusNovoprotein--
Milli-Q Plus超纯水系统Millipore--
β-actin抗体Biossbs-0061R
Bax抗体Cell Signaling Technology5023S
Bcl-2抗体Cell Signaling Technology15071S
caspase-3抗体Cell Signaling Technology9662S
caspase-8抗体Cell Signaling Technology9746S
caspase-9抗体Cell Signaling Technology9508S
CHOP抗体Cell Signaling Technology2895S
细胞色素c抗体Cell Signaling Technology11940S
DR5抗体Cell Signaling Technology69400S
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGZhongshan Golden BridgeZB-2301
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgGZhongshan Golden BridgeZB-2305
Agilent 7800电感耦合等离子体质谱仪Agilent Technologies--
酶标仪Bio-Rad--
EVOS FL Auto 2荧光显微镜ThermoFisher Scientific--
BD FACS Aria II流式细胞仪BD Bioscience--
StepOnePlus实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
Image Quant LAS 500化学发光成像仪Fujifilm--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
多糖提取与硒化
提取条件(固液比、酶量、pH、温度、时间)、硒化条件(HNO3浓度、Na2SeO3用量、反应温度和时间)
阅读提示:Methods 2.2
细胞培养与处理
细胞系(HT-29)、培养基(McCoy's 5A)、FBS浓度、处理浓度(50-800 μg/mL)和时间(24、48h)
阅读提示:Methods 2.3
凋亡检测
Annexin V-FITC/PI染色步骤、流式细胞仪设置、阳性对照(5-FU)和阴性对照
阅读提示:Methods 2.7
蛋白表达检测
抗体信息(品牌、货号、稀释比例)、蛋白上样量、抑制剂使用浓度
阅读提示:Methods 2.9
基因表达检测
引物序列、内参基因(β-actin)、PCR条件、数据分析方法
阅读提示:Methods 2.8