多糖提取与硒化
获得龙眼多糖并进行化学硒化,制备不同硒含量的硒化多糖。
采用酶辅助水提法提取LP,并用HNO3–Na2SeO3反应体系制备SeLP1和SeLP2。
Enhanced Growth Inhibition and Apoptosis Induction in Human Colon Carcinoma HT-29 Cells of Soluble Longan Polysaccharides with a Covalent Chemical Selenylation
包含细胞模型(HT-29)体外实验,涵盖细胞活力、形态、凋亡、ROS、钙离子、线粒体膜电位、基因和蛋白表达及抑制剂验证等多层级验证,且具有统计重复。
人结肠癌HT-29细胞
处理浓度:LP、SeLP1、SeLP2处理浓度为50–800 μg/mL 处理时间:24和48小时,及14、21天克隆形成实验 阳性对照:5-FU(100 μmol/L) 无机硒对照:Na2SeO3(1–16 μg/mL) 凋亡检测:Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得龙眼多糖并进行化学硒化,制备不同硒含量的硒化多糖。
采用酶辅助水提法提取LP,并用HNO3–Na2SeO3反应体系制备SeLP1和SeLP2。
评估多糖样品对HT-29细胞增殖的抑制作用。
用MTT法检测不同浓度和处理时间下的细胞活力。
观察处理后的细胞形态变化。
用Hoechst 33258染色观察细胞核形态。
评估长期增殖抑制效果。
细胞处理48h后继续培养14或21天,染色计数。
检测ROS、Ca2+和线粒体膜电位变化,评估凋亡诱导。
使用荧光探针JC-1、DCFH-DA和Fura-2 AM分别检测MMP、ROS和Ca2+。
定量分析细胞凋亡率。
Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞仪检测。
检测凋亡相关基因mRNA表达水平。
RT-qPCR检测Bax、Bcl-2等8个基因表达。
检测凋亡相关蛋白表达水平,并验证caspase-3作用。
Western blot检测蛋白表达,并用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Wisent Inc. | -- | |
| 细胞增殖检测 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 5-氟尿嘧啶 | Aladdin | -- | |
| 多糖提取 | 果胶酶 | Aladdin | -- |
| 纤维素酶 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 钙离子检测 | Fura-2 AM荧光探针 | Beyotime | -- |
| 细胞培养及染色 | 二甲基亚砜 | Beyotime | 67-68-5 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞核染色 | Hoechst 33258荧光染料 | Beyotime | -- |
| 抑制剂实验 | caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO | Beyotime | -- |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞染色 | 结晶紫染色液 | Beyotime | -- |
| 线粒体膜电位检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) | Beyotime | -- |
| RNA提取 | RNAprep Pure细胞细菌RNA提取试剂盒 | Tiangen | -- |
| RT-qPCR | NovoScript®两步法RT-PCR试剂盒 | Novoprotein | -- |
| SYBR qPCR SuperMix Plus | Novoprotein | -- | |
| 纯水制备 | Milli-Q Plus超纯水系统 | Millipore | -- |
| Western blot | β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R |
| Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 5023S | |
| Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 15071S | |
| caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662S | |
| caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 9746S | |
| caspase-9抗体 | Cell Signaling Technology | 9508S | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895S | |
| 细胞色素c抗体 | Cell Signaling Technology | 11940S | |
| DR5抗体 | Cell Signaling Technology | 69400S | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Zhongshan Golden Bridge | ZB-2301 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Zhongshan Golden Bridge | ZB-2305 | |
| 硒含量检测 | Agilent 7800电感耦合等离子体质谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| MTT检测 | 酶标仪 | Bio-Rad | -- |
| 细胞形态观察 | EVOS FL Auto 2荧光显微镜 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 流式凋亡检测 | BD FACS Aria II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| RT-qPCR | StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| Western blot | Image Quant LAS 500化学发光成像仪 | Fujifilm | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多糖提取与硒化 | 提取条件(固液比、酶量、pH、温度、时间)、硒化条件(HNO3浓度、Na2SeO3用量、反应温度和时间) 阅读提示:Methods 2.2 |
| 细胞培养与处理 | 细胞系(HT-29)、培养基(McCoy's 5A)、FBS浓度、处理浓度(50-800 μg/mL)和时间(24、48h) 阅读提示:Methods 2.3 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI染色步骤、流式细胞仪设置、阳性对照(5-FU)和阴性对照 阅读提示:Methods 2.7 |
| 蛋白表达检测 | 抗体信息(品牌、货号、稀释比例)、蛋白上样量、抑制剂使用浓度 阅读提示:Methods 2.9 |
| 基因表达检测 | 引物序列、内参基因(β-actin)、PCR条件、数据分析方法 阅读提示:Methods 2.8 |