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        泛癌分析识别来源于转座子的肿瘤特异性抗原

        Pan-cancer analysis identifies tumor-specific antigens derived from transposable elements

        作者信息Nakul M Shah, H Josh Jang, Yonghao Liang, Ju Heon Maeng, Shin-Cheng Tzeng, Angela Wu, Noah L Basri, Xuan Qu, Changxu Fan, Amy Li, Benjamin Katz, Daofeng Li, Xiaoyun Xing, Bradley S Evans, Ting Wang
        PMID36973455
        期刊Nat Genet
        发布时间2023-04
        DOI10.1038/s41588-023-01349-3
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        研究涵盖多个独立证据层级：大规模转录组筛选、细胞系验证（nanoCAGE）、蛋白质组学验证（CPTAC质谱）、HLA肽段质谱及膜蛋白功能验证，且包含功能验证（Western blot、免疫荧光）和机制验证（TP53相关性及体外实验）。

        主要模型

        TCGA肿瘤样本（33种癌症类型） GTEx正常成体组织 癌细胞系（675种，包括HCT116、DMS 53等） HCT116 p53敲除细胞系

        重点核对

        肿瘤特异性筛选：TE-嵌合转录本在TCGA肿瘤中的表达需至少1 TPM，且有唯一剪接连接支持 HLA结合预测：使用NetMHCpan-4.0预测TS-TEA与HLA等位基因的结合亲和力 质谱验证：在CPTAC数据中严格筛选唯一肽段，以及在HLA-pulldown中验证TS-TEA 膜蛋白验证：通过Western blot和免疫荧光确认TE-嵌合膜蛋白在细胞表面表达 TP53功能验证：在HCT116细胞中过表达p53诱导剂处理，观察TE-嵌合转录本变化

        摘要

        转座子（TE）内的隐性启动子在肿瘤中被转录重新激活，产生新的TE-嵌合转录本，这些转录本可以产生免疫原性抗原。我们对33种TCGA肿瘤类型、30种GTEx成体组织和675种癌细胞系进行了迄今最全面的TE外显子化事件筛选，并鉴定了1,068个具有产生共享肿瘤特异性TE嵌合抗原（TS-TEAs）潜力的候选事件。产生的全细胞裂解液和HLA下拉质谱数据证实，TS-TEAs在癌细胞表面呈递。此外，我们强调了从TE启动子转录的肿瘤特异性膜蛋白，它们可以在癌细胞细胞外表面暴露新的表位。在此，我们展示了TS-TEAs和非典型膜蛋白的高泛癌患病率，这些蛋白可用于治疗开发和靶向。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        肿瘤中转座子隐性启动子的外显子化事件能否产生共享的、肿瘤特异性的抗原，并可作为免疫治疗靶点？
        核心机制
        转座子中的隐性启动子在肿瘤中被表观遗传去抑制，导致TE-嵌合转录本的表达，这些转录本可翻译为肿瘤特异性TE嵌合蛋白，其中一部分通过HLA-I呈递或作为膜蛋白暴露于细胞表面。
        主要证据
        利用TCGA和GTEx转录组数据鉴定2,297个肿瘤特异性TE-嵌合转录本；通过CPTAC质谱数据验证53个TS-TEP；通过HLA-pulldown质谱在DMS 53细胞系中验证4个TS-TEA；通过Western blot和免疫荧光验证膜蛋白L1PA2_GABRG2和THE1C_TMEM260。
        研究意义
        TS-TEAs和TE-嵌合膜蛋白具有高泛癌患病率和共享性，可作为开发泛癌疫苗或CAR-T等免疫治疗策略的靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        TE-嵌合转录本的鉴定

        在泛癌数据中识别所有TE外显子化事件。

        对TCGA 33种癌症类型的10,357个肿瘤样本进行RNA-seq分析，使用stringtie组装转录本，并与GENCODE v25和Repeatmasker注释比较，筛选出由TE启动子起始并剪接到下游基因的嵌合转录本。

        2

        肿瘤特异性筛选

        筛选仅在肿瘤中表达而不在正常成体组织中表达的TE-嵌合转录本。

        利用GTEx 11,686个成人组织样本和FANTOM5启动子图谱，去除在正常成体组织中有表达的候选事件。

        3

        肿瘤特异性TE嵌合蛋白的预测

        预测TE-嵌合转录本编码的蛋白质产物及其抗原性。

        使用两种方法预测开放阅读框：最长ORF和Kozak上下文强起始密码子。根据ORF类型将产物分为正常、截短、嵌合正常、嵌合截短或移码，并利用Pfam和TMHMM注释蛋白结构域。

        4

        细胞系表达验证

        在癌细胞系中验证TE-嵌合转录本的表达。

        将TCGA候选事件在675个癌细胞系中进行RNA-seq筛查，并选取10个细胞系进行nanoCAGE-seq验证启动子活性。

        5

        蛋白质组学验证

        验证TS-TEP蛋白在肿瘤样本中的存在。

        下载CPTAC BRCA和OV样本的质谱数据，使用包含TS-TEP序列的定制数据库进行搜索，严格过滤唯一肽段。

        6

        HLA呈递验证

        验证TS-TEA在癌细胞表面HLA-I分子的呈递。

        对四个癌细胞系（DMS 53, NCI-H716, SNU-475, NCI-H2228）进行HLA-pulldown LC-MS/MS，使用MaxQuant分析并过滤出唯一肽段。

        7

        膜蛋白表面呈递验证

        验证TE-嵌合膜蛋白在细胞表面表达并暴露TE-嵌合表位。

        提取细胞膜蛋白，通过Western blot检测L1PA2_GABRG2和THE1C_TMEM260，并使用免疫荧光和定制抗体确认其表面定位。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        转录组数据分析
        StringTie RNA-seq组装nanoCAGE测序
        表观遗传和突变关联分析
        全局甲基化分析ATAC-seq分析驱动突变关联分析
        蛋白产物预测和结构分析
        开放阅读框预测Pfam结构域注释TMHMM跨膜预测
        质谱蛋白质组学
        质谱分析HLA下拉液相色谱-串联质谱免疫沉淀后质谱分析
        细胞实验验证
        蛋白质印迹免疫荧光细胞培养和药物处理
        生物信息学预测
        NetMHCpan HLA结合预测BLAT序列比对

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养McCoy's 5A（改良）培养基Gibco16600082
        FetalPUREGenesee Scientific25-525
        青霉素-链霉素ThermoFisher Scientific15140-122
        药物处理Nutlin-3MedChem ExpressHY-50696
        盐酸多柔比星Fisher ChemicalBP25165
        Western blot抗P53兔多克隆抗体Proteintech10442-1-AP
        抗CDKN1A兔多克隆抗体Proteintech10355-1-AP
        抗β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology#4967L
        细胞培养RPMI-1640培养基ThermoFisher Scientific11875-085
        RPMI-1640培养基ATCC30-2001
        Waymouth培养基ThermoFisher Scientific11220-035
        GlutaMAX补充剂ThermoFisher Scientific35050-61
        DMEM培养基ThermoFisher Scientific11965-084
        EMEM培养基ATCC30-2003
        Eagle最低必需培养基ATCC30-2003
        CELLine CL350培养瓶Argos TechnologiesEW-24406-54
        RNA提取Dynabeads mRNA直接纯化试剂盒ThermoFisher Scientific61011
        RNA处理末端外切酶LucigenTER51020
        HLA下拉Protein A-琼脂糖4B微珠ThermoFisher Scientific101041
        Poly-Prep色谱柱Bio-Rad7311550
        质谱Orbitrap Fusion Lumos质谱仪Thermo Fisher Scientific--
        Dionex Ultimate 3000 RSLCnano高效液相色谱Thermo Fisher Scientific--
        膜蛋白提取质膜蛋白提取试剂盒abcamab65400
        Western blot蓝色上样缓冲液套装Cell Signaling Technology7722S
        Novex 8% Tris-甘氨酸迷你凝胶Thermo Fisher ScientificXP00080BOX
        抗GABRG2抗体Proteintech14104-1-AP
        抗TMEM260抗体Novus BiologicalsNBP1-91525
        抗兔二抗Cell Signaling Technology#7074
        myECL成像仪Thermo Scientific62236
        免疫沉淀Protein A Dynabeads磁珠Thermo10001D
        免疫荧光多聚鸟氨酸Sigma-AldrichP2533
        层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
        牛血清白蛋白Cell Signaling Technology#9998
        CD98抗体Proteintech15193-1-AP
        二抗Thermo FisherA-11008
        DAPISigma AldrichD9542

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        TE-嵌合转录本鉴定
        肿瘤特异性过滤条件：GTEx和FANTOM5的表达阈值
        阅读提示：Methods: Candidate filtering for tumor-specificity
        TP53功能实验
        HCT116细胞系培养条件、Nutlin-3和Doxorubicin处理浓度及时间
        阅读提示：Methods: In vitro TP53 manipulation
        HLA-pulldown
        细胞系（DMS 53等）、重复次数、HLA抗体（W6/32）和裂解条件
        阅读提示：Methods: HLA class I Antigen Isolation from Cancer Cell Lines
        膜蛋白验证
        细胞系（H1623、SR等）、膜蛋白提取试剂盒、抗体类型及稀释比例
        阅读提示：Methods: Plasma membrane protein isolation and Western blot methods

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