人IPF和BLM小鼠肺免疫肽组分析
鉴定纤维化组织中MHC I类限制性肽的组成和特征。
从8例IPF患者和4例非IPF供体的肺组织，以及BLM或PBS处理的小鼠肺组织中，通过免疫沉淀和LC-MS/MS分析MHC I类免疫肽组。
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肺纤维化中的免疫肽组分析为识别治疗靶点提供了平台
Immunopeptidome profiling in pulmonary fibrosis provides a platform for identifying therapeutic targets
实验完整度
高包含人IPF组织免疫肽组分析、BLM小鼠模型免疫肽组与单细胞测序、肽疫苗体内治疗、T细胞功能验证、人CTL体外杀伤等多个独立证据层级，并进行机制验证。
主要模型
人IPF肺组织外植体 BLM诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化模型 小鼠原代肌成纤维细胞和巨噬细胞 人IPF来源的肌成纤维细胞和M2巨噬细胞
重点核对
BLM剂量：3 mg/kg，单次气管内滴注 肽疫苗剂量和时间：50 μg/只，第0、7、14天肌内注射 MHC I类肽筛选标准：结合亲和力<1000 nM T细胞杀伤实验效应靶细胞比例：1:1、3:1、9:1
摘要
纤维化是许多慢性疾病的严重病理结局，然而靶向改变的I类主要组织相容性复合体（MHC）免疫肽组的治疗潜力在很大程度上仍未得到探索。在此，我们表征了来自人特发性肺纤维化肺外植体纤维化灶和博来霉素处理小鼠的I类MHC免疫肽组，鉴定了一系列纤维化相关肽。对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的平行分析使得能够计算性地优先确定治疗靶点。在体内，用三个候选肽（MAF116–124、APBB270–78和TNS3119–127）进行的治疗性疫苗接种有效减轻了博来霉素处理小鼠的纤维化进展。此外，利用其进化保守性，我们发现MAF116–124引发了特异性人细胞毒性T淋巴细胞，这些细胞裂解了源自人特发性肺纤维化的肌成纤维细胞和M2样巨噬细胞。这项研究表明，免疫肽组分析为发现可转化的抗纤维化免疫疗法提供了一个强大的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索纤维化条件下是否增加MHC I类限制性肽的整体呈递，病理细胞群是否呈递疾病特异性MHC I类肽，以及是否可基于病理细胞群相关MHC I类配体设计治疗性疫苗。
- 核心机制
- 肽疫苗诱导的抗原特异性CD8+ T细胞通过释放颗粒酶B，直接杀伤纤维化相关的肌成纤维细胞和巨噬细胞，从而减轻纤维化。
- 主要证据
- 在BLM小鼠模型中，MAF116–124、APBB270–78和TNS3119–127疫苗减轻纤维化，并诱导特异性CD8+ T细胞；MAF116–124可激活人CTL裂解IPF来源的肌成纤维细胞和M2巨噬细胞。
- 研究意义
- 该研究表明免疫肽组分析为发现可转化的抗纤维化免疫疗法提供了平台，并为MHC I类限制性肽疫苗的临床应用提供了概念验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
表征BLM诱导肺纤维化中的细胞组成，并识别纤维化相关细胞亚群。
对BLM和PBS处理小鼠的整个左肺进行scRNA-seq分析，识别免疫细胞和基质细胞亚群。
Fib-SCORE管道开发
整合免疫肽组和单细胞数据，优先排序纤维化相关肽抗原。
开发评分管道，根据肽的差异丰度、MHC I类结合亲和力和靶细胞特异性对肽进行排序。
肽疫苗体内疗效评估
评估候选肽疫苗在BLM诱导肺纤维化模型中的治疗效果。
在BLM处理前或后，对小鼠进行MAF116–124、APBB270–78或TNS3119–127的肌内免疫，评估肺指数、羟脯氨酸含量和组织学改变。
抗原特异性CD8+ T细胞应答检测
验证疫苗是否诱导抗原特异性CD8+ T细胞应答。
使用ELISpot、CFSE增殖实验、MHC I类四聚体染色和流式细胞术检测脾脏和肺中的CD8+ T细胞应答。
MAF116–124的细胞毒性功能验证
验证MAF116–124特异性CD8+ T细胞对纤维化相关靶细胞的杀伤作用。
将MAF116–124疫苗诱导的CD8+ T细胞与原代肌成纤维细胞、M2巨噬细胞等共培养，检测特异性裂解。
人CTL诱导和功能验证
验证MAF116–124在人体中诱导CTL并杀伤IPF来源细胞。
从HLA-A*02:01健康供体PBMC中诱导MAF116–124特异性CTL，检测其对IPF来源肌成纤维细胞和M2巨噬细胞的杀伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫肽组富集 | NeoDiscovery免疫肽组富集试剂盒 | BaizhenBio | BZNEO-H-I-10 |
| NeoDiscovery试剂盒 | BaizhenBio | BZNEO-M-I-10 | |
| LC-MS/MS | 纳升高效液相色谱系统 | Bruker | -- |
| timsTOF Pro2质谱仪 | Bruker | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| Ficoll-Paque PLUS | -- | -- | |
| ELISpot | ELISpot试剂盒 | R&D Systems | ELD5819 |
| 流式细胞术 | NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- |
| 动物实验 | 博来霉素 | MCE | -- |
| TCR测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| KC-Digital链特异性TCR-seq文库制备试剂盒 | Seqhealth Technology | DT0813-02 | |
| 组织学染色 | Pannoramic MIDI数字切片扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| 免疫荧光 | Vectra 3自动定量病理成像系统 | Akoya Biosciences | -- |
| IRISKit HyperView mTSA试剂盒 | Chengdu LUMINIRIS Bio Tech | MH900804 | |
| Evident VS200切片扫描系统 | Evident | -- | |
| 透射电镜 | JEM-1400FLASH透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 分子对接 | Discovery Studio软件 | -- | -- |
| T细胞分选 | 泛T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19851 |
| 细胞杀伤实验 | 7-AAD | Abcam | -- |
| T2细胞 | Shanghai Kanglang Biotechnology | KL-C1793H |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫肽组分析 | BLM剂量和给药方式；样本类型（纤维化灶或正常组织）；MHC I类抗体；质谱参数 阅读提示：本文Methods 'Immunopeptidome data processing of sample preparation and MS analysis'、'Mouse experimental procedures' |
| 单细胞转录组分析 | 细胞过滤标准；数据归一化方法；聚类参数；细胞亚群标记基因 阅读提示：本文Methods 'scRNA-seq data processing'、'Dimensionality reduction and clustering' |
| 肽疫苗治疗 | 肽序列和纯度；疫苗剂量；免疫时间；BLM处理时间 阅读提示：本文Methods 'Preparation of peptide vaccine'、'Mouse experimental procedures'、图5和图8图注 |
| T细胞功能检测 | ELISpot肽浓度和刺激时间；四聚体类型；杀伤实验效应靶比例和共培养时间 阅读提示：本文Results 'Peptide vaccines induce antifibrotic immunity'、'MAF116–124 reprograms the fibrotic microenvironment'、'MAF116–124 activates human antifibrotic cytotoxic T lymphocytes' |
| 人CTL诱导 | DC分化因子浓度；成熟细胞因子鸡尾酒；MOI；CTL扩增周期 阅读提示：本文Methods 'Induction of peptide-specific CTLs' |
| 体内过继转移 | 供体T细胞数量和转移时间；BLM处理时间 阅读提示：本文Results 'MAF116–124 activates human antifibrotic cytotoxic T lymphocytes'、方法 'Adoptive transfer of T cells' |