全基因组CRISPR-Cas9筛选
识别CBFA2T3::GLIS2 AML中的选择性基因依赖性。
对CBFA2T3::GLIS2阳性细胞系（CMS、M-07e、WSU-AML）进行全基因组CRISPR-Cas9筛选，分析DepMap数据及WSU-AML drop-out筛选。
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确定CBFA2T3::GLIS2急性髓系白血病的靶向治疗
Identifying targeted therapies for CBFA2T3::GLIS2 acute myeloid leukemia
实验完整度
高包含体外细胞系功能验证、体内移植瘤模型、药物筛选、耐药机制研究及患者来源异种移植模型等多个独立证据层级。
主要模型
CBFA2T3::GLIS2阳性AML细胞系（CMS、M-07e、WSU-AML） NSGS小鼠异种移植模型 CBFA2T3::GLIS2患者来源异种移植（PDX）模型
重点核对
JAK2依赖性的验证使用多西环素诱导的敲除系统，在体外和体内模型中确认。 ruxolitinib和CHZ868的体外活性在多个CBFA2T3::GLIS2阳性细胞系中验证。 耐药机制通过CRISPR-Cas9 ruxolitinib锚定筛选和慢性处理产生的耐药亚系共同确认。 ruxolitinib与MEK抑制剂（trametinib/selumetinib）的协同效应在细胞系和PDX模型中验证。 JAK2在体内实验中的敲除效率通过TIDE分析确认。
摘要
CBFA2T3::GLIS2阳性儿童急性髓系白血病（AML）仍是最具不良预后亚组之一。为发现该疾病亚型的创新靶向治疗方法，我们进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，结果凸显出JAK2相比其他类型癌症具有强选择性依赖性。利用多西环素诱导的JAK2敲除（KO）系统，我们在CBFA2T3::GLIS2细胞系中验证了JAK2依赖性，观察到体外和体内增殖受损以及体外凋亡诱导。I型（ruxolitinib）和II型（CHZ868）JAK2抑制剂在CBFA2T3::GLIS2阳性AML模型中均显示出选择性体外活性。为了确定对JAK2抑制剂的耐药和增敏机制，我们在CBFA2T3::GLIS2 AML中使用了CRISPR-Cas9 ruxolitinib锚定筛选。靶向MAPK通路负调控因子的sgRNA在ruxolitinib处理的细胞中富集。同样，在慢性ruxolitinib处理下产生耐药的CBFA2T3::GLIS2 AML亚系表达了致病性NRAS突变。这两种方法都汇聚于MAPK通路激活作为对ruxolitinib治疗的耐药机制。将ruxolitinib与MEK抑制剂联合使用，在表达融合蛋白的细胞系和患者来源异种移植（PDX）细胞中显示出协同效应，并在CBFA2T3::GLIS2 AML PDX中显示出体内活性，提示这是一种针对这种预后不良AML亚型信号通路的潜在方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CBFA2T3::GLIS2阳性急性髓系白血病是否存在可靶向的特定依赖性，以及如何克服对JAK2抑制剂的耐药性？
- 核心机制
- MAPK通路激活（通过RASA2等负调控因子缺失或NRAS突变）是CBFA2T3::GLIS2 AML对ruxolitinib耐药的主要机制。
- 主要证据
- CRISPR-Cas9筛选显示JAK2为选择性依赖，ruxolitinib锚定筛选富集MAPK负调控因子sgRNA，耐药亚系获得NRAS突变，联合JAK和MEK抑制剂在体外细胞系和体内PDX模型中显示协同效应。
- 研究意义
- 本研究为CBFA2T3::GLIS2 AML提出JAK2作为潜在治疗靶点，并支持联合JAK和MEK抑制剂作为克服耐药、改善预后的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
JAK2依赖性功能验证
验证JAK2敲除对CBFA2T3::GLIS2 AML细胞生长和凋亡的影响。
使用多西环素诱导的JAK2敲除系统，通过竞争性生长实验、细胞活力检测和凋亡分析评估JAK2缺失的影响。
体内JAK2依赖性评估
评估JAK2缺失对CBFA2T3::GLIS2 AML在体内进展的影响。
将表达多西环素诱导sgJAK2的WSU-AML细胞注射入NSGS小鼠，通过白血病负担和生存期评估JAK2缺失的效果。
JAK2抑制剂敏感性测试
检测CBFA2T3::GLIS2阳性细胞系对JAK2抑制剂的敏感性。
使用ruxolitinib、CHZ868和tofacitinib处理CBFA2T3::GLIS2阳性及阴性细胞系，评估细胞活力。
耐药机制识别
识别对ruxolitinib的耐药机制和潜在的联合治疗靶点。
进行CRISPR-Cas9 ruxolitinib锚定筛选，并生成慢性ruxolitinib处理的耐药亚系，分析逃逸突变。
联合治疗评估
评估JAK2和MEK抑制剂联合治疗在CBFA2T3::GLIS2 AML中的协同效应。
在细胞系和PDX模型中测试ruxolitinib与trametinib或selumetinib的联合效果，并在体内PDX模型中验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Mediatech | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Mediatech | -- | |
| IMDM培养基 | Mediatech | -- | |
| 人粒细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 人干细胞因子 | PeproTech | -- | |
| 人促血小板生成素 | PeproTech | -- | |
| 人FMS样酪氨酸激酶3配体 | PeproTech | -- | |
| 人白细胞介素3 | PeproTech | -- | |
| 人白细胞介素6 | PeproTech | -- | |
| 支原体PCR检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MP0035 | |
| CRISPR-Cas9筛选 | 血液DNA提取试剂盒 | Takara | 740954.20 |
| 细胞培养 | Fugene转染试剂 | Promega | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| EGFP报告载体pXPR_047 | Addgene | 107145 | |
| FgH1tUTG载体 | Addgene | 70183 | |
| Cas9-T2A-mCherry载体 | Addgene | 70182 | |
| 病毒包装 | pCMV-VSV-G包装质粒 | Addgene | 8454 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7571 |
| 流式分析 | APC Annexin V凋亡检测试剂盒 | BioLegend | 640932 |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | C10634 | |
| FxCycle Violet染料 | Invitrogen | F10347 | |
| V450抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 560368 | |
| APC-Cy7抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 557659 | |
| BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD Celesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 流式分选 | BD FACS Aria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Thermofisher | 89900 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermofisher | 78429 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906845001 | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| JAK2 (D2E12)抗体 | Cell Signaling Technology | 3230S | |
| pJAK2 (Tyr1007/1008)抗体 | Cell Signaling Technology | 3771S | |
| pSTAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145S | |
| STAT3 (124H6)抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| pSTAT5 (Tyr694)抗体 | Cell Signaling Technology | 9351 | |
| STAT5 (D2O6Y)抗体 | Cell Signaling Technology | 94305S | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967L | |
| MEK1/2 (L38C12)抗体 | Cell Signaling Technology | 4694S | |
| pMEK1/2 (Ser217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| pAKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| pERK (Thr980)抗体 | Cell Signaling Technology | 16F8 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) (127F5)抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 黏着斑蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4650 | |
| RASA2抗体 | Sigma Aldrich | HPA035374 | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Cell Signaling Technology | 7074, | |
| Amersham Imager 680成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| 药物处理 | 鲁索替尼 | Selleck Chemicals | S1378 |
| 托法替尼 | Selleck Chemicals | S2789 | |
| 曲美替尼 | Selleck Chemicals | S2673 | |
| 司美替尼 | Selleck Chemicals | S1008 | |
| CHZ868 | MedChem Express | HY-18960 | |
| 动物实验 | 含多西环素的食物 | -- | -- |
| 鲁索替尼（体内用） | LC Labs | R-6600 | |
| 司美替尼（体内用） | Shanghai Medicilon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基组成，包括FBS浓度、细胞因子添加。 阅读提示：Methods: Cell culture and PDX samples |
| CRISPR-Cas9筛选 | sgRNA文库版本、MOI、筛选持续时间、ruxolitinib浓度。 阅读提示：Methods: CRISPR-Cas9 screens |
| JAK2敲除验证 | 多西环素浓度和诱导时间、sgRNA序列。 阅读提示：Methods: Confirmation of sgRNA editing; Results: JAK2 depletion impairs viability and induces apoptosis in vitro |
| 体内异种移植 | 小鼠品系、细胞注射数量、多西环素食物浓度、处理方案。 阅读提示：Methods: Xenograft transplantation; Results: JAK2 is essential for AML progression in vivo |
| 药物敏感性测试 | 药物浓度范围、处理时间、细胞接种密度。 阅读提示：Methods: Drug response testing |
| 耐药细胞系生成 | ruxolitinib起始浓度、递增方案、耐药判定标准。 阅读提示：Methods: Generation of resistant cell lines |
| 联合治疗评估 | 药物剂量、给药方式、治疗周期、检测指标。 阅读提示：Methods: Synergy analysis; Results: Combined JAK and MEK inhibition improve cytotoxicity in CBFA2T3::GLIS2 AML |