筛选快速降解的cystinosin突变体
鉴定导致胱氨酸病的快速降解的cystinosin突变体。
构建37个疾病相关CTNS突变体与GFP融合，在HEK293细胞中表达，通过CHX chase assay检测蛋白稳定性，发现cystinosin(7Δ)快速降解。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
内质网相关降解在胱氨酸病发病机制中的作用及精准医学前景
ER-associated degradation in cystinosis pathogenesis and the prospects of precision medicine
实验完整度
高包含体外细胞模型、患者成纤维细胞、多种功能验证（降解、定位、泛素化）及机制验证（遗传和化学抑制），并通过化学伴侣功能恢复实验验证治疗潜力。
主要模型
HEK293细胞 HeLa细胞 患者成纤维细胞
重点核对
cystinosin(7Δ)突变体的鉴定及降解现象 ER滞留与ERAD降解途径的验证 化学伴侣处理对蛋白稳定性和胱氨酸水平的挽救效果
摘要
胱氨酸病是一种溶酶体贮积病，其特征是二肽胱氨酸在溶酶体腔内蓄积。它是由胱氨酸外排转运体胱氨酸蛋白(cystinosin)的突变引起的。大多数临床报道的突变是由于转运功能丧失所致。在本研究中，我们鉴定了一个快速降解的疾病变异体，称为cystinosin(7Δ)。我们证明该突变体滞留在内质网(ER)中，并通过内质网相关降解(ERAD)途径被降解。利用遗传和化学抑制方法，我们阐明了HRD1、p97、EDEMs和蛋白酶体复合物在cystinosin(7Δ)降解途径中的作用。在了解降解机制后，我们测试了一些先前用于治疗CFTR F508Δ的化学伴侣，并证明它们可以促进cystinosin(7Δ)的折叠和运输。令人惊讶的是，化学伴侣治疗可以将腔内胱氨酸水平降低约70%。我们相信，我们的研究确凿地建立了ERAD与胱氨酸病发病机制之间的联系，并证明了使用化学伴侣治疗cystinosin(7Δ)的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- cystinosin(7Δ)突变体是否通过ERAD途径降解，以及化学伴侣能否恢复其功能以治疗胱氨酸病。
- 核心机制
- cystinosin(7Δ)突变体滞留于ER，被HRD1、p97、EDEMs和蛋白酶体复合物通过ERAD途径降解，化学伴侣可促进其折叠和运输至溶酶体。
- 主要证据
- 通过CHX追踪、亚细胞定位分析、ERAD组分抑制/敲除实验、活细胞成像和患者成纤维细胞实验，证明7Δ经ERAD降解；化学伴侣处理可使溶酶体胱氨酸水平降低约70%。
- 研究意义
- 该研究建立了ERAD与胱氨酸病发病机制的联系，提示化学伴侣可作为该突变型胱氨酸病的精准医学治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证cystinosin(7Δ)的亚细胞定位和降解位点
确定cystinosin(7Δ)在细胞内的定位及降解途径。
通过免疫荧光和生化分离（Lyso-IP、Optiprep梯度）确定ER和溶酶体分布；使用BafA1和MG132处理确定降解位点，并用泛素化检测和ERAD组分抑制/敲除验证ERAD参与。
活细胞成像验证ER降解
在活细胞水平确认cystinosin(7Δ)在ER中降解。
使用旋转盘共聚焦显微镜对稳定表达cystinosin(7Δ)-GFP的HeLa细胞进行延时成像，观察CHX处理后ER信号的消失，或用Kifunensine处理后的稳定。
化学伴侣处理挽救功能
测试化学伴侣能否恢复cystinosin(7Δ)的功能并降低溶酶体胱氨酸水平。
用CFTR correctors C3和C4处理患者成纤维细胞，检测蛋白稳定性和溶酶体胱氨酸水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测蛋白稳定性
分析亚细胞定位
检测分子相互作用
基因敲除和敲降
检测蛋白修饰
检测功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| Ham's F12培养基 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| Plasmocin抗菌剂 | Invivogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine RNAimax转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 巴弗洛霉素A1 | -- | -- |
| MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- | |
| Kifunensine | -- | -- | |
| Corr-4a | -- | -- | |
| C3 | -- | -- | |
| C4 | -- | -- | |
| 蛋白裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Biotool | -- |
| Western blot | Bradford试剂 | -- | -- |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| Odyssey CLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| CL-XPosure胶片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | Hoechst染料 | -- | -- |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| 显微镜 | DeltaVision Elite系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| Olympus UPLXAP0100X物镜 | Olympus | -- | |
| 流式细胞术 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Ze5流式细胞仪 | Bio-Rad | -- | |
| 活细胞成像 | Nikon CSU-X1转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 质谱分析 | N-乙基马来酰亚胺 | -- | -- |
| 磺基水杨酸 | -- | -- | |
| His8-USP7 | Bio-techne | E-519-025 | |
| 抗体 | 抗GFP抗体 | Torrey Pines Biolabs | TP401 |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-lg | |
| 抗胱氨酸蛋白抗体 | -- | -- | |
| 抗LAMP2抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4B4 | |
| 抗CTSD抗体 | Cell Signaling Technology | 2284 | |
| Tom20抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-17764 | |
| HRD1抗体 | Proteintech | 134723-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| VDAC 1/2抗体 | Proteintech | 10866-1-AP | |
| 抗HA抗体 | Life technologies | 715500 | |
| 抗p97抗体 | gift from Dr. Yanzhuang Wang | -- | |
| Western blot | 山羊抗小鼠IRDye680LT | Licor | 92668020 |
| 山羊抗小鼠IRDye800CW | Licor | 92632210 | |
| 山羊抗兔IRDye680LT | Licor | 92632211 | |
| 山羊抗兔IRDye800CW | Licor | 92632210 | |
| 抗兔HRP | Jackson Immunoresearch | JI 111-035-003 | |
| 免疫荧光 | Cy-5山羊抗小鼠 | Jackson Immunoresearch | JI 115-175-166 |
| 质谱分析 | GFP-TrapA磁珠 | Chromotek | -- |
| Lyso-IP | 抗HA磁珠 | Millipore-Sigma | -- |
| 细胞培养 | Mycoalert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 免疫沉淀 | USP7去泛素化酶 | Bio-techne | E-519-025 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | 细胞系来源、培养基成分、转染试剂和DNA量。 阅读提示：Methods: Mammalian cell culture, Transient transfection |
| 蛋白稳定性检测 | CHX作用浓度和时间，细胞系类型。 阅读提示：Methods: Cycloheximide chase |
| 降解机制验证 | BafA1和MG132浓度及处理时间，HRD1 KO和p97 siRNA序列。 阅读提示：Methods: Cycloheximide chase, siRNA knockdown, Generation of HRD1 KO cell line |
| 化学伴侣处理 | C3和C4浓度及处理时间，患者成纤维细胞来源。 阅读提示：Methods: Mass spectrometry to analyze lysosomal cystine levels, Results and Figure 7 |