生物信息学筛选酶识别基序突变
系统鉴定癌症中酶识别基序的体细胞突变，并筛选出有意义的候选突变。
开发算法搜索 TCGA 中所有酶识别基序的获得或缺失突变，重点关注 AGC 激酶基序，发现 BUD13-R156C 和 -R230Q 突变。
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BUD13 的体细胞功能获得性突变通过破坏 Fbw7 功能促进肿瘤发生
Somatic gain-of-function mutations in BUD13 promote oncogenesis by disrupting Fbw7 function
实验完整度
高包含生物信息学分析、细胞功能实验（2D/3D 集落形成、细胞活力）、体内异种移植实验、分子机制研究（免疫共沉淀、体外激酶实验）等多层级验证。
主要模型
人结直肠癌细胞系 DLD1 人结直肠癌细胞系 HCT116 人结直肠癌细胞系 HT29 小鼠异种移植模型（ nude mice ）
重点核对
BUD13 突变体（R156C、R230Q）在 DLD1 细胞中的表达 BUD13 敲除及回补实验（DLD1 细胞） RSK3 介导的 BUD13 磷酸化 Fbw7-Cul1 复合物形成 Torin 2 处理对细胞生长的影响
摘要
发生在关键酶上的体细胞突变已被广泛研究，并开发出具有临床前景的靶向疗法。然而，酶通过不同底物发挥的上下文依赖性功能使靶向特定酶变得复杂。在这里，我们开发了一种算法来阐明一类新的体细胞突变，这些突变发生在酶识别基序上，癌症可能利用这些突变促进肿瘤发生。我们验证了 BUD13-R156C 和 -R230Q 突变逃避 RSK3 介导的磷酸化，并具有增强的致瘤性，可促进结肠癌生长。进一步的机制研究表明，BUD13 是内源性 Fbw7 抑制剂，可稳定 Fbw7 的致癌底物，而癌性 BUD13-R156C 或 -R230Q 干扰 Fbw7Cul1 复合物的形成。我们还发现 BUD13 的这种调控在响应 mTOR 抑制中发挥关键作用，可用于指导治疗选择。我们希望我们的研究揭示酶识别基序突变的图谱，并提供公开可用的资源，为癌症劫持的体细胞突变促进肿瘤发生提供新的见解，并具有患者分层和癌症治疗的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌症是否通过酶识别基序突变（如 BUD13 的 AGC 激酶基序突变）来促进肿瘤发生，其分子机制和治疗意义是什么？
- 核心机制
- BUD13 作为内源性 Fbw7 抑制剂，通过竞争性结合稳定 Fbw7 底物（如 c-Jun）；BUD13-R156C 或 -R230Q 突变无法被 RSK3 磷酸化，增强与 Fbw7 的结合，进而破坏 Fbw7-Cul1 复合物形成，导致底物降解受阻，促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 在 DLD1 等结直肠癌细胞中，BUD13 突变体促进 2D/3D 集落形成和异种移植肿瘤生长；免疫共沉淀和泛素化实验证明 BUD13 突变体增强与 Fbw7 结合并抑制底物降解；体内外实验证实 Torin 2 治疗对表达 BUD13 突变体的细胞更敏感。
- 研究意义
- 揭示酶识别基序突变在癌症中的重要作用，为患者分层和靶向 mTORC2 的治疗选择提供潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证 BUD13 突变体磷酸化缺陷
确认 BUD13-R156C 和 -R230Q 是否逃避 RSK3 介导的磷酸化。
通过免疫印迹检测 AGC 基序磷酸化，使用 RSK3 敲低、过表达、激酶抑制剂和体外激酶实验证明 RSK3 是主要激酶，且 T159/S235 为磷酸化位点。
评估 BUD13 突变体对结肠癌细胞生长的影响
检验 BUD13 突变体是否促进结肠癌细胞生长，包括体内和体外。
在多种结直肠癌细胞中敲除 BUD13 并回补 WT 或突变体，进行 2D 集落形成、3D 软琼脂和异种移植实验，并检测 c-Jun 表达。
阐明 BUD13 调控 Fbw7 的分子机制
揭示 BUD13 及其突变体如何影响 Fbw7 活性。
通过免疫共沉淀和免疫印迹检测 BUD13 与 Fbw7 的相互作用、对底物泛素化和稳定性的影响，以及 Fbw7-Cul1 复合物形成。
评估 BUD13 对 mTOR 抑制治疗的影响
探讨 BUD13 表达是否影响结肠癌细胞对 mTOR 抑制剂的敏感性。
用 Torin 2 和 mTORC1 抑制剂处理 DLD1 细胞，检测细胞活力和 c-Jun 水平，并验证 Rictor 敲低的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | MG132 | Selleck | S2619 |
| BI-D1870 | Selleck | S2843 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 杀稻瘟菌素 | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| 集落形成 | 碘硝基四氮唑蓝 | Sigma-Aldrich | I10406 |
| 细胞活力检测 | MTT | Sigma-Aldrich | 475989 |
| 免疫沉淀 | 抗 Flag 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | A-2220 |
| 抗 HA 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | A-2095 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | Cayman Chemical | 13346 |
| Torin2 | Cayman Chemical | 14185 | |
| MK2206 | Cayman Chemical | 11593 | |
| GSK2110 | Cayman Chemical | 17988 | |
| S6K1-I | Cayman Chemical | 15018 | |
| 帕唑帕尼 | Cayman Chemical | 12097 | |
| 克唑替尼 | Cayman Chemical | 12087 | |
| 依维莫司 | Cayman Chemical | 11597 | |
| 替西罗莫司 | Cayman Chemical | 11590 | |
| 体外激酶实验 | 活性 RSK3 蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 50-199-8827 |
| 药物处理 | JR-AB2-011 | MedChemExpress | HY-122022 |
| 免疫印迹 | 抗 Myc 标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 |
| 抗 HA 抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗磷酸化 Akt 底物 (RXRXXpS*/pT*) 抗体 | Cell Signaling Technology | 10001 | |
| 抗磷酸化 AKT (Ser473) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗磷酸化 p70 S6 激酶 (Thr389) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗磷酸化 S6 核糖体蛋白 (Ser240/244) 抗体 | Cell Signaling Technology | 5364 | |
| 抗磷酸化 4EBP1 (Thr37/46) 抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗磷酸化 IRF3 抗体 (Ser386) | Cell Signaling Technology | 37829 | |
| 抗 IRF3 抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗 IRF7 抗体 | Cell Signaling Technology | 4920 | |
| 抗磷酸化 TBK1 (Ser172) 抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗 TBK1 抗体 | Cell Signaling Technology | 51872 | |
| 抗 STING 抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗 c-Myc 抗体 | Cell Signaling Technology | 18583 | |
| 抗 RSK1/2/3 抗体 | Cell Signaling Technology | 9347 | |
| 抗 Rictor 抗体 | Cell Signaling Technology | 9476 | |
| 抗 Rbx1 抗体 | Cell Signaling Technology | 11922 | |
| 抗 Skp1 抗体 | Cell Signaling Technology | 12248 | |
| 抗兔 IgG HRP 连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠 IgG HRP 连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗细胞周期蛋白 E 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-198 | |
| 抗 β-连环蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-59737 | |
| 抗 c-Jun 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-45 | |
| 抗 GST 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-459 | |
| 抗 Cul1 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-11384 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25336 | |
| 多克隆抗 Flag 抗体 | Sigma-Aldrich | F-7425 | |
| 单克隆抗 Flag 抗体 (clone M2) | Sigma-Aldrich | F-3165 | |
| 抗 α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T-5168 | |
| 抗 BUD13 抗体 | Proteintech | 20163-1-AP | |
| 抗 Fbw7 抗体 | Proteintech | 28424-1-AP | |
| 质粒构建 | 定点突变试剂盒 | Agilent | 200523 |
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 克隆 | pRP[Exp]-Bsd-CMV-hBUD13-HA 载体 | Vector Builder | -- |
| pCMV-GST 载体 | -- | -- | |
| pLenti-GFP-Blasticidin 载体 | -- | -- | |
| pET28a 载体 | -- | -- | |
| pCDNA3-HA 载体 | -- | -- | |
| pCDNA3-Flag 载体 | -- | -- | |
| lentiCRISPRv2-puro 载体 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Bimake | -- | |
| NanoDrop OneC | -- | -- | |
| Bio-Rad 蛋白定量试剂 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | GST 沉降 | -- | -- |
| 抗 Flag 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗 HA 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞活力检测 | BioTek Cytation 5 细胞成像读板仪 | BioTek | -- |
| Transwell 实验 | 24 孔板小室 | Corning Life Sciences | 3422 |
| 细胞培养 | NCRNU-M-M 小鼠 | University of North Carolina Animal Facility | -- |
| 体外激酶实验 | His-BUD13 蛋白 | -- | -- |
| 大肠杆菌 BL21 菌株 | -- | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与培养 | 所用细胞系（DLD1、HCT116、HT29、Caco2、Colo320）、培养基（DMEM+10% FBS+青霉素/链霉素）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and transfection |
| 基因敲除与回补 | BUD13 sgRNA 序列、lentiCRISPRv2-puro 载体、嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml）和时长（72h）、回补病毒载体（pLenti-GFP-Blasticidin）、杀稻瘟菌素浓度（2 mg/ml 或 2.5 mg/ml） 阅读提示：Materials and methods - Plasmids; 图例中相关实验描述 |
| 磷酸化验证 | BUD13 突变体（R156C、R230Q）、RSK3 表达（WT 或 K112R）、BI-D1870 处理浓度和时间（0.1-10 μM，18h）、血清饥饿及刺激条件（无血清过夜，胰岛素 100 ng/ml 30min，EGF 100 ng/ml 10min） 阅读提示：Results 及图 2 图例 |
| 细胞功能实验 | 2D 集落形成（接种密度 500 或 1000 细胞/well，培养 10-15 天）、3D 软琼脂（底层 0.8%，顶层 0.4%，细胞数 3×10^4，培养 2-5 周）、MTT 检测（浓度 0.5 mg/ml，孵育 3-4h，测 590nm） 阅读提示：Materials and methods - Colony formation assays, Soft agar assays, Cell viability assays |
| 体内异种移植 | 细胞接种量（DLD1/HCT116 2×10^6，Caco2 5×10^6）、小鼠品系（NCRNU-M-M，4 周龄雌性）、监测频率（每 2-4 天）、实验时长（3-5 周） 阅读提示：Materials and methods - Mouse xenograft assays |
| 生化实验 | 免疫沉淀条件（1mg 总蛋白，4°C 3-4h）、洗涤缓冲液（NETN）、MG132 浓度（10 mM）及处理时间（过夜或 16h）、泛素化实验（Ni-NTA pulldown） 阅读提示：Materials and methods - Immunoblot and immunoprecipitations analyses; 图 4 图例 |
| 药物处理 | Torin 2 浓度（0-5 μM）和处理时间（24h 或 72h）、mTORC1 抑制剂（rapamycin, temsirolimus, everolimus）浓度、S6K 抑制剂浓度、JR-AB2-011 浓度 阅读提示：Results 及图 7 图例、图 S5 图例 |