验证RAC2变体的激活状态
确定患者来源的RAC2点突变是否为功能获得性突变，并评估其与PAK1的结合能力。
在HEK293T细胞中表达HA标记的RAC2 WT及突变体（Q61E, Q61R, D57N, D63V, E62K, G12R, G12V, A59S），通过GST–PAK–RBD pull-down实验检测RAC2活化水平。
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RAC2功能获得性变异导致先天性免疫错误并驱动NLRP3炎症小体活化
RAC2 gain-of-function variants causing inborn error of immunity drive NLRP3 inflammasome activation
实验完整度
高包含体外NLRP3炎症小体重建系统、患者原代细胞检测、细胞系基因敲除验证及单细胞RNA-seq等多层级证据，并进行了功能与机制验证。
主要模型
HEK293T NLRP3炎症小体重建系统 RAC2 E62K突变患者外周血白细胞 RAC2 A59S突变患者外周血单核细胞及巨噬细胞 U937单核细胞系及NLRP3/GSDMD/NINJ1敲除亚系
重点核对
RAC2变体的激活状态：Q61R, E62K, D63V, G12R, A59S为功能获得性，D57N为功能抑制性 PAK1结合能力：GST–PAK–RBD pull-down实验验证激活态RAC2突变体与PAK结合增强 NLRP3炎症小体抑制剂（MCC950）、PAK抑制剂（IPA3, AZ13711265）和泛Caspase抑制剂（Emricasan）的效应 NLRP3 T659A磷酸化位点突变减弱RAC2突变诱导的IL-1β分泌 患者来源巨噬细胞中LPS刺激后的IL-1β和IL-18分泌水平
摘要
越来越多的患者被发现患有由单等位基因RAC2变异引起的严重联合免疫缺陷。RHO GTP酶RAC2的表达仅限于造血谱系。RAC2变异已被描述为导致与高频率感染、白细胞减少和自身炎症特征相关的免疫缺陷。在这里，我们表明特定的RAC2激活突变诱导NLRP3炎症小体活化，导致巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18。这种活化取决于RAC2变异的激活状态，并由下游激酶PAK1介导。抑制RAC2–PAK1–NLRP3炎症小体通路可能被视为这些患者的潜在治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAC2功能获得性变异是否以及如何激活NLRP3炎症小体，从而驱动相关免疫缺陷患者的炎症表型？
- 核心机制
- RAC2功能获得性突变增强其与PAK1的结合，促进PAK1介导的NLRP3磷酸化（T659），导致NLRP3炎症小体活化，进而激活Caspase-1，促进IL-1β和IL-18的成熟与分泌，该过程依赖于GSDMD但不依赖NINJ1。
- 主要证据
- 在HEK293T重建系统中，RAC2功能获得性突变体（Q61R, E62K, D63V, G12R, A59S）诱导pro-IL-1β剪切和IL-1β分泌，而D57N突变体无此效应；患者外周血单核/粒细胞中Caspase-1活性及speck形成增加；患者来源巨噬细胞LPS刺激后IL-1β分泌增加且被MCC950抑制；U937细胞中NLRP3或GSDMD敲除消除该分泌。
- 研究意义
- 揭示RAC2–PAK1–NLRP3信号轴作为治疗RAC2功能获得性变异相关免疫缺陷的潜在药物靶点，并提示这些患者可能患有一种新型炎症小体相关疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NLRP3炎症小体重建实验
检测RAC2功能获得性突变体是否能够激活NLRP3炎症小体并促进IL-1β分泌。
在HEK293T细胞中共转染NLRP3炎症小体组分（myc-NLRP3, ASC-GFP, Caspase-1, pro-IL-1β-Flag）和RAC2突变体，检测上清中剪切型IL-1β的分泌。
抑制剂阻断实验
验证RAC2突变诱导的NLRP3炎症小体活化是否依赖于PAK、NLRP3和Caspase活性。
在重建系统中加入PAK抑制剂（IPA3, AZ13711265）、NLRP3抑制剂MCC950或泛Caspase抑制剂Emricasan（转染前6小时处理），检测对IL-1β分泌的影响。
患者样本检测
评估RAC2功能获得性突变对患者循环髓系细胞中Caspase-1活性的影响。
从RAC2 E62K或A59S患者及健康对照外周血中分离白细胞，使用FAM–YVAD–FLICA探针标记活性Caspase-1，通过流式细胞术检测单核细胞和粒细胞中的荧光强度及speck形成。
原代巨噬细胞功能验证
验证RAC2功能获得性突变在人类原代巨噬细胞中是否促进IL-1β和IL-18分泌。
从健康供体外周血分离单核细胞并分化为巨噬细胞，用慢病毒载体表达RAC2突变体（或空载体），LPS刺激后ELISA检测IL-1β和IL-18分泌。
机制验证（NLRP3 T659A和U937 KO细胞）
验证NLRP3 T659磷酸化位点和GSDMD在RAC2突变诱导IL-1β分泌中的作用。
在HEK293T重建系统中使用NLRP3 T659A突变体；在U937细胞中敲除NLRP3或GSDMD，检测RAC2突变体诱导的IL-1β分泌和细胞毒性。
转录组分析
评估RAC2 E62K突变对髓系细胞转录组的影响，特别是IL-1β相关基因表达。
在MOLM-13细胞中过表达RAC2 WT或E62K，进行bulk RNA-seq；对RAC2 A59S患者血液进行单细胞RNA-seq，分析细胞类型和NLRP3、IL-1β表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测RAC2活性
验证NLRP3炎症小体活化
测量细胞因子分泌
评估细胞毒性
检测Caspase-1活化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| NLRP3炎症小体重建实验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| GST–PAK–RBD pull-down实验 | GST–PAK–RBD融合蛋白 | -- | -- |
| 抑制剂处理 | MCC950 | Sigma-Aldrich | -- |
| IPA-3 | Tocris | -- | |
| AZ13711265 | AGV Discovery | -- | |
| Emricasan | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞分化 | 1α,25-二羟基维生素D3 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞刺激 | 超纯脂多糖 | Invivogen | -- |
| 尼日利亚霉素 | Invivogen | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 含Glutamax-I的RPMI 1640培养基 | Life Technologies | -- | |
| 巨噬细胞分化 | 集落刺激因子-1 | Miltenyi | -- |
| 细胞分离 | Ficoll分离液 | Cytiva | -- |
| 裂解缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| 单核细胞纯化 | 抗CD14磁珠 | Miltenyi | -- |
| autoMACS Pro分离器 | Miltenyi | -- | |
| 免疫印迹 | LDS样品缓冲液 | Pierce | -- |
| 二硫苏糖醇 | Euromedex | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | BioRad | -- | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| PXi4 GeneSys成像系统 | Syngene | -- | |
| 小鼠抗Caspase-1抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 | |
| 小鼠抗NLRP3抗体（克隆Cryo-2） | Adipogen | AG-20B-0014 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | AG-20B-0014 | |
| 小鼠抗Flag抗体（克隆M2） | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 小鼠抗GFP抗体（克隆7.1, 13.1） | Roche | 11814460 | |
| 小鼠抗HA抗体（克隆16B12） | BioLegend | 901515 | |
| 小鼠抗GST抗体（克隆26H1） | CST | 2624 | |
| 山羊抗小鼠免疫球蛋白HRP | Agilent Technologies | P044701-2 | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗NLRP3抗体（克隆Cryo-2） | Adipogen | AG-20B-0014 |
| 兔抗ASC抗体 | Adipogen | AG-25B-0006 | |
| TexasRed标记抗小鼠IgG | Vector Laboratories | TI-2000 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Life Technologies | A21206 | |
| 鬼笔环肽iFluor 647偶联物 | Abcam | ab176759 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Nikon A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞因子检测 | 人IL-1β DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY201 |
| 人总IL-18 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY318 | |
| LDH释放检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | FAM–YVAD–FLICA探针 | Bio-Rad | ICT098 |
| APC-Vio 770抗CD10抗体 | Miltenyi Biotec | 130-114-505 | |
| Vioblue抗CD14抗体 | Miltenyi Biotec | 130-110-524 | |
| PE抗CD16抗体 | Miltenyi Biotec | 130-113-393 | |
| APC抗CD45抗体 | Miltenyi Biotec | 130-110-633 | |
| PE-Vio 770抗CD66b抗体 | Miltenyi Biotec | 130-119-768 | |
| Cytek Aurora流式细胞分析仪 | Cytek | -- | |
| FlowJo v.10.8.1 | FlowJo | -- | |
| 质粒构建 | QuickChange定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| InFusion HD克隆试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| pCDNA3.1-HA3-RAC2质粒 | -- | -- | |
| HIVSFFV-IRESGFP慢病毒载体 | -- | -- | |
| PAX2包装质粒 | Addgene | #35002 | |
| pCMV-VSV-G包膜质粒 | Addgene | #8454 | |
| 靶向NINJ1的sgRNA（来自Brunello文库） | Addgene | -- | |
| pKLV-U6gRNA(BbsI)-PGKpuro2ABFP载体 | Addgene | #50946 | |
| 基因敲除 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 单细胞RNA-seq | Chromium单细胞基因表达Flex | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NLRP3炎症小体重建实验 | HEK293T细胞转染的质粒组合及剂量、转染时间（16小时）、RAC2突变体表达水平、检测IL-1β剪切的方法 阅读提示：Materials and methods: 'Reconstituted NLRP3 inflammasome in HEK293T cell system'和Figure 2 legend |
| 抑制剂处理实验 | 抑制剂浓度（MCC950 10 μM, IPA-3 5 μM, AZ13711265 1 μM, Emricasan 5 μM）、处理时间（转染前6小时）、溶剂对照 阅读提示：Materials and methods: 'Cell isolation, culture, and reagents'和Figure 3 legend |
| 患者外周血白细胞检测 | 患者RAC2突变类型（E62K或A59S）、FAM–YVAD–FLICA探针浓度及孵育时间（1小时）、流式抗体组合、门控策略（单核细胞、粒细胞、淋巴细胞） 阅读提示：Materials and methods: 'Flow cytometry analysis'和Figure 4 legend |
| 原代巨噬细胞转导与刺激 | 单核细胞分离及分化条件（CSF-1 100 ng/ml, 6天）、慢病毒转导MOI（10）及时间（72小时）、LPS浓度（100 ng/ml）及刺激时间（8小时）、ELISA检测的细胞因子 阅读提示：Materials and methods: 'Cell isolation, culture, and reagents'和'Plasmid constructs, lentiviral particle production, and macrophage transduction' |
| U937敲除细胞实验 | U937细胞分化条件（维生素D3 10 ng/ml, 72小时）、敲除基因（NLRP3, GSDMD, NINJ1）、转导时间（72小时）、LPS刺激时间（8小时）、IL-1β ELISA检测 阅读提示：Materials and methods: 'Cell isolation, culture, and reagents'和Figure 5 legend |
| RNA-seq分析 | MOLM-13细胞转导MOI（30）及时间（7小时）、RNA提取方法、测序平台、数据分析流程（CellRanger、Seurat）、单细胞RNA-seq的细胞数和批次效应处理 阅读提示：Materials and methods: 'Bulk RNAseq and single-cell RNAseq analysis' |