CRISPR筛选鉴定PTPN23
在BRAF突变黑色素瘤细胞中鉴定生存必需基因。
在YUMM1.7-Cas9细胞中转导CRISPR删除文库（针对药物靶点、激酶和磷酸酶），培养14天后进行NGS测序，分析sgRNA富集情况。
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PTPN23依赖的PI3KC2α激活是BRAF突变癌症的治疗脆弱点
PTPN23-dependent activation of PI3KC2α is a therapeutic vulnerability of BRAF-mutant cancers
实验完整度
高包含CRISPR筛选、体外细胞系功能实验、体内异种移植瘤模型、黑色素细胞特异性基因敲除小鼠模型、转录组/蛋白质组/磷酸化组学、临床样本分析等多个独立证据层级，并包含机制验证。
主要模型
BRAF突变黑色素瘤细胞系（A375、SK-MEL-28等） BRAF突变结直肠癌细胞（HT-29、RKO） 患者来源BRAF突变结直肠癌类器官 BRAFV600E驱动的黑色素瘤小鼠模型 异种移植瘤模型（A375、RKO、Vemu耐药A375）
重点核对
PTPN23敲低在BRAF突变细胞系中选择性抑制生长并诱导凋亡，需验证shRNA脱靶效应及回补实验 PTPN23与PI3KC2α及WNK3的相互作用及PI3KC2α S329磷酸化水平 PTPN23敲低对PI(3,4)P2水平和AKT2、GSK3β磷酸化的影响 PTPN23缺失与BRAF抑制剂联用的协同抑瘤效果，需明确给药剂量和方案 PTPN23敲除对BRAFV600E驱动的黑色素瘤发生的影响，需使用条件性敲除小鼠模型
摘要
BRAF突变驱动多种肿瘤的发生和进展。虽然BRAF抑制剂对BRAF突变黑色素瘤患者有效，但对该疗法的内在或获得性耐药很常见。在这里，我们确定非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶23（PTPN23）是BRAF突变癌细胞中另一个有效的靶点。沉默PTPN23选择性地杀死BRAF突变的黑色素瘤细胞，但对BRAF野生型的细胞没有影响。机制上，PTPN23是一种催化失活的磷酸酶，有趣的是，它诱导WNK3介导的磷脂酰肌醇3-激酶II类α（PI3KC2α）在丝氨酸329位点的磷酸化，增强其催化活性。这种激活促进PI(3,4)P2的产生，随后激活内体上的AKT2，以支持细胞存活。单独或与BRAF抑制剂联合使用，遗传或药理学靶向PTPN23-PI3KC2α-AKT2信号轴，在体外和体内均能有效抑制BRAF突变黑色素瘤和其他癌症的生长。我们还证明，黑色素细胞特异性敲除PTPN23显著抑制BRAFV600E驱动的黑色素瘤发生。总之，我们的研究结果表明，靶向PTPN23/PI3KC2α为BRAF突变癌症提供了一种新的可行治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找BRAF突变癌症的新治疗靶点，以克服BRAF抑制剂的内在或获得性耐药。
- 核心机制
- PTPN23作为支架蛋白招募WNK3，促进PI3KC2α在S329位点的磷酸化，增强其催化活性，产生PI(3,4)P2，进而激活内体上的AKT2信号通路，支持BRAF突变癌细胞存活。
- 主要证据
- CRISPR筛选鉴定PTPN23为BRAF突变黑色素瘤生存必需基因；敲低PTPN23选择性抑制BRAF突变细胞生长并诱导凋亡；PTPN23与PI3KC2α、WNK3相互作用；PTPN23敲低降低PI3KC2α S329磷酸化、PI(3,4)P2水平及AKT2、GSK3β磷酸化；回补PI3KC2α S329D或AKT2 S474D可挽救细胞生长；体内实验中PTPN23敲低或药理学抑制PI3KC2α/AKT2可抑制肿瘤生长，PTPN23敲除延迟BRAFV600E驱动的黑色素瘤发生。
- 研究意义
- 揭示BRAF突变癌症对PTPN23-PI3KC2α-AKT信号轴的依赖性，为BRAF突变癌症提供新的治疗策略，可与BRAF抑制剂联合使用或用于耐药肿瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PTPN23对BRAF突变癌细胞生长的影响
验证PTPN23在BRAF突变癌细胞中的必要性及选择性。
使用shRNA敲低PTPN23，检测细胞活力、集落形成、凋亡和蛋白表达变化。
机制研究：PTPN23调控PI3KC2α-AKT轴
阐明PTPN23调控细胞存活的分子机制。
利用RNA-seq、蛋白质组学、磷酸化组学分析PTPN23敲低后的表达和磷酸化变化；通过免疫沉淀、免疫荧光、细胞分级等验证PTPN23与PI3KC2α、WNK3的相互作用及亚细胞定位；通过PI(3,4)P2检测、AKT磷酸化分析等验证信号通路。
体内验证PTPN23对肿瘤生长的影响
评估PTPN23在体内对BRAF突变肿瘤生长的作用。
将PTPN23敲低的BRAF突变细胞异种移植到裸鼠，或使用PTPN23条件敲除小鼠与BRAFV600E；PTEN缺失小鼠交配，观察黑色素瘤发生。
评估BRAF抑制剂联合治疗的潜力
测试PTPN23抑制与BRAF抑制剂联合的抗肿瘤效果。
在体外和异种移植模型中，联合PTPN23敲低与BRAF抑制剂（Vemu或Dabr）处理，评估细胞活力和肿瘤生长。
药理学靶向PI3KC2α或AKT2的效应
评估小分子抑制剂PITCOIN1（PI3KC2α抑制剂）和CCT128930（AKT2抑制剂）对BRAF突变癌症的抑制效果。
用不同浓度抑制剂处理BRAF突变和野生型细胞，检测细胞活力、凋亡、信号通路蛋白变化；并在异种移植模型中评估抑瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养试剂 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140148 | |
| 药物处理试剂 | 维莫非尼 | Selleck | S1267 |
| 达拉非尼 | Selleck | S2807 | |
| CCT128930 | Selleck | S2635 | |
| 多西环素盐酸盐 | Aladdin | D111943 | |
| 抑制剂处理 | Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | Selleck | S8037 | |
| 巴弗洛霉素A1 | CST | 54645S | |
| PI3KC2α抑制 | PITCOIN1 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | C0043 |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7572 | |
| 集落形成 | 结晶紫染液 | Beyotime | C0121 |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒 | Multi Sciences | AP105 |
| 流式分析 | CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| PVDF膜 | Merck | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705061 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RT-qPCR | GeneJET RNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0732 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| 2× SYBR Green qPCR预混液 | Selleck | B21203 | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Mowiol 4-88封片剂 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Dragonfly共聚焦显微镜系统 | Andor | -- | |
| 免疫沉淀 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Selleck | B14001 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Selleck | B15001 | |
| 抗DYKDDDDK磁珠 | Thermo Fisher Scientific | A36798 | |
| 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88836 | |
| Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88802 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67兔多克隆抗体 | Servicebio | GB111499-100 |
| 抗裂解的caspase-3兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11532-100 | |
| 小鼠/兔特异性HRP/DAB检测免疫组化试剂盒 | Abcam | ab64264 | |
| HistoCore PELORIS 3组织脱水机 | Leica Biosystems | -- | |
| HistoCore Arcadia包埋机 | Leica Biosystems | -- | |
| HistoCore NANOCUT R切片机 | Leica Biosystems | -- | |
| 苏木素 | Merck | H3136 | |
| VS200玻片扫描仪 | Olympus | -- | |
| 多重免疫荧光 | Opal 6重检测试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL811001KT |
| PhenoCycler-Fusion系统 | Akoya Biosciences | -- | |
| 类器官培养 | 肿瘤类器官解离试剂盒 | AimingMed | 100-050 |
| 基质胶 | BD Biosciences | 354230 | |
| 结直肠癌类器官培养基 | AimingMed | 100-067 | |
| 类器官凋亡检测 | Caspase-3/7染料 | Sartorius | 4440 |
| Incucyte活细胞分析系统 | Sartorius | 4647 | |
| 质谱分析 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| Q Exactive Plus四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| CRISPR筛选 | Cas9-Blast质粒 | Addgene | 52962 |
| 小鼠CRISPR删除文库（药物靶点、激酶、磷酸酶） | Addgene | 1000000122 | |
| 血液/细胞基因组DNA小提试剂盒 | QIAGEN | 13362 | |
| DNA突变构建 | KOD-Plus-定点突变试剂盒 | TOYOBO | SMK-101 |
| 磷酸酶活性检测 | DiFMUP荧光底物 | Thermo Fisher Scientific | D6567 |
| PI(3,4)P2处理 | PI(3,4)P2 | Avanti | 850153P |
| Shuttle PIP载体2 | Echelon | P-9C2 | |
| 细胞分级 | Minute内体分离与细胞分级试剂盒 | Invent | ED-028 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | YUMM1.7-Cas9细胞的构建、文库感染复数（MOI=0.3）、puromycin筛选浓度（3 μg/ml）及时间（6天）、筛选周期（14天）、文库覆盖度（1000×） 阅读提示：Materials and methods: CRISPR screening |
| PTPN23敲低/过表达 | shRNA靶序列（shPTPN23-1/2等）、转染/感染试剂及方法、puromycin筛选浓度（2 μg/ml）、dox诱导浓度（2 μM） 阅读提示：Materials and methods: DNA constructs, Cell transfection and infection |
| 细胞活力检测 | 细胞铺板密度（4000细胞/孔）、检测时间（72小时）、CCK8或CellTiter-Glo试剂用量及孵育时间（CCK8 1小时，CellTiter-Glo 10分钟） 阅读提示：Materials and methods: Cell viability assay |
| 异种移植瘤实验 | 细胞接种数量（3×10^6）、基质胶比例（50%）、肿瘤体积计算方式（0.5×长×宽^2）、给药方案（dox 400 ppm饮食、Vemu 20 mg/kg灌胃、PITCOIN1 10 mg/kg灌胃、CCT128930 15 mg/kg腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: Xenograft mouse models |
| 体内基因敲除实验 | 小鼠品系（Tyr-CreERT2、BrafV600E、PtenLoxP/LoxP、Ptpn23LoxP/LoxP）、他莫昔芬诱导方案、观察时间（90天）、基因型鉴定方法 阅读提示：Materials and methods: Animal models, 图10 |