建立肥胖高血压小鼠模型
评估肥胖合并高血压对心脏重构的影响。
小鼠喂食高脂饮食（HFD）16周，在最后4周通过Alzet微量渗透泵灌注AngII（1,000 ng/kg/min）或生理盐水，并设低脂饮食（LFD）对照组。
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巨噬细胞来源的uPA激活脂肪细胞分泌的PDGF-D促进肥胖小鼠中AngII诱导的心脏重构
PDGF-D activation by macrophage-derived uPA promotes AngII-induced cardiac remodeling in obese mice
实验完整度
高包含脂肪细胞特异性基因敲除/过表达、骨髓移植、细胞共培养、RNA-seq等多层级功能与机制验证。
主要模型
高脂饮食诱导的肥胖小鼠 脂肪细胞特异性PDGF-D敲除小鼠 脂肪细胞特异性PDGF-D过表达转基因小鼠 原代心脏成纤维细胞
重点核对
高脂饮食（HFD，60% kcal脂肪）诱导肥胖，AngII以1,000 ng/kg/min灌注28天 脂肪细胞特异性PDGF-D敲除（Adipoq-Cre; Pdgfd flox/flox）和过表达（Ap2启动子驱动的PA-Tg）小鼠 巨噬细胞清除（抗CSF-1R抗体，1 mg，每2天腹腔注射）验证巨噬细胞依赖性 骨髓移植（BMT）敲低uPA（uPA shRNA慢病毒）验证巨噬细胞来源uPA的作用 PDGF-DD浓度（20 μM）和Akt抑制剂perifosine（5 μM）处理原代心脏成纤维细胞
摘要
肥胖诱导的脂肪组织衍生因子分泌紊乱对心脏损伤很重要。然而，新发现的脂肪因子血小板衍生生长因子-D（PDGF-D）是否在血管紧张素II（AngII）灌注的肥胖小鼠中调节心脏重构尚不清楚。在这里，我们发现肥胖诱导脂肪组织中的PDGF-D表达，并且在AngII灌注后与对照组瘦小鼠相比，心脏重构更严重。脂肪细胞特异性PDGF-D敲除减轻了肥胖小鼠的高血压性心脏重构。一致地，脂肪细胞特异性PDGF-D过表达转基因小鼠（PA-Tg）在不经高脂饮食处理的情况下，AngII灌注后表现出加重的心脏重构。机制研究表明，AngII刺激的巨噬细胞产生尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），通过将全长PDGF-D剪接为有活性的PDGF-DD来激活PDGF-D。此外，骨髓特异性uPA敲低降低了心脏中有活性的PDGF-DD水平，并改善了HFD高血压小鼠的心脏重构。总之，我们的数据首次提供了巨噬细胞与脂肪细胞之间新的相互作用模式：巨噬细胞来源的uPA激活脂肪细胞分泌的PDGF-D，最终加速肥胖小鼠中AngII诱导的心脏重构。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂肪细胞来源的PDGF-D是否以及如何参与肥胖小鼠高血压性心脏重构，并探究与巨噬细胞的相互作用。
- 核心机制
- 巨噬细胞来源的uPA通过剪接全长PDGF-D为活性PDGF-DD，激活PDGF-D，进而通过PI3K-Akt信号通路促进心脏重构。
- 主要证据
- 脂肪细胞特异性PDGF-D敲除或过表达改变AngII诱导的心脏重构；巨噬细胞清除或uPA敲低阻断PDGF-D的活化及心脏重构加重；PDGF-DD激活PI3K-Akt通路促进成纤维细胞增殖和纤维化。
- 研究意义
- 该研究揭示了巨噬细胞与脂肪细胞相互作用的新模式，靶向uPA/PDGF-D通路可能成为预防肥胖时高血压性心脏损伤的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂肪细胞特异性PDGF-D敲除/过表达验证其对心脏重构的影响
验证脂肪细胞来源的PDGF-D在高血压心脏重构中的因果作用。
构建脂肪细胞特异性PDGF-D敲除小鼠（Adipoq-Cre; Pdgfd flox/flox）和过表达小鼠（PA-Tg），在HFD+AngII或仅AngII条件下，通过超声心动图、组织学染色和qPCR评估心脏重构。
验证巨噬细胞在PDGF-D加重心脏重构中的必要性
确定巨噬细胞是否参与PDGF-D介导的心脏重构。
通过免疫荧光和流式细胞术检测心脏中巨噬细胞浸润；在PA-Tg小鼠中用抗CSF-1R抗体清除巨噬细胞，评估心脏重构变化；体外用PDGF-D KO成纤维细胞与巨噬细胞共培养。
验证巨噬细胞来源的uPA激活PDGF-D
探究巨噬细胞激活脂肪细胞分泌PDGF-D的具体机制。
Western blot检测心脏中全长PDGF-D和活性PDGF-DD水平；免疫荧光共定位uPA和F4/80；使用条件培养基实验证明uPA剪接PDGF-D。
体内验证巨噬细胞uPA敲低对心脏重构的影响
验证巨噬细胞来源的uPA在体内是否通过激活PDGF-D影响心脏重构。
进行骨髓移植（BMT）：将uPA shRNA慢病毒感染的骨髓细胞移植到HFD小鼠，再AngII灌注，评估心脏中PDGF-D活化水平及心脏重构。
RNA-seq和信号通路机制验证
揭示PDGF-DD促进心脏重构的下游信号通路。
对PDGF-D KO心脏成纤维细胞进行PDGF-DD刺激后RNA-seq，KEGG和GSEA富集到PI3K-Akt通路；用perifosine抑制验证对成纤维细胞增殖和纤维化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 高脂饮食D12492 | Research Diets | -- |
| 低脂饮食D12450 | Research Diets | -- | |
| ALZET微型渗透泵 | ALZET | -- | |
| 血管紧张素II | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| IBMX | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 罗格列酮 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组PDGF-DD | -- | -- |
| 哌立福辛 | -- | -- | |
| 病毒转染 | uPA shRNA慢病毒 | GeneChem | -- |
| 对照shRNA慢病毒 | GeneChem | -- | |
| 抗体 | Col1a1抗体 | Abcam | ab34710 |
| PDGF-D抗体 | Invitrogen | 40-2100 | |
| F4/80抗体 | Abcam | ab6640 | |
| uPA抗体 | Proteintech | 17968-1-AP | |
| uPA抗体（WB） | Proteintech | 7968-1-AP | |
| PDGFRβ抗体 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
| 磷酸化PDGFRβ抗体 | Cell Signaling Technology | 3161 | |
| Col1a1抗体 | Cell Signaling Technology | 91144S | |
| PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4257T | |
| 磷酸化PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4228T | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9271T | |
| CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2546T | |
| 磷酸化CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2561S | |
| P70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708T | |
| 磷酸化P70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234T | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 555二抗 | Invitrogen | -- |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | -- | |
| WGA-FITC | Sigma-Aldrich | L4895 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 巨噬细胞清除 | 抗CSF-1R抗体 | Bioxcell | BP0213 |
| 流式细胞术 | CD45-FITC抗体 | eBioscience | 11-0451-85 |
| F4/80-eFluor 450抗体 | eBioscience | 48-4801-82 | |
| 胶原酶I | -- | -- | |
| 胶原酶XI | -- | -- | |
| Percoll分离液 | GE | 17089102 | |
| 细胞分离 | Miltenyi Biotec离解试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-098-373 |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| ABI PRISM 7900HT系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | 增强化学发光检测系统 | -- | -- |
| EdU检测 | Cell-Light EdU Apollo 594体外成像试剂盒 | Ribobio | -- |
| RNA-seq | 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| NanoDrop 2000 | -- | -- | |
| TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | HFD喂养时长（4个月）、AngII剂量（1,000 ng/kg/min）、灌注时间（28天）、小鼠周龄和性别 阅读提示：Materials and methods: Animals and animal care; Figure 1 legend |
| 基因工程小鼠 | PDGF-D flox小鼠的构建方法、Adipoq-Cre小鼠来源、PA-Tg小鼠构建细节 阅读提示：Materials and methods: Animals and animal care; Supplementary Figure S2 |
| 巨噬细胞清除 | 抗CSF-1R抗体剂量（1 mg）、给药频率（每2天）、给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: Depletion of macrophages; Supplementary Figure S3 |
| 骨髓移植 | 照射剂量（10 Gy）、移植细胞数（1×10^7）、移植后恢复时间（2周） 阅读提示：Materials and methods: BMT; Figure 5 legend |
| 细胞处理 | PDGF-DD处理浓度（20 μM）和时间（12 h）、perifosine浓度（5 μM）、CFs分离方法 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Recombinant lentivirus; Figure 7 legend |