EAE模型诱导与临床评分
确定AIM2对EAE发病的影响
使用不同剂量Mtb诱导类型A和B EAE，在WT、AIM2−/−和ASC−/−小鼠中评估临床评分、脊髓病理和免疫细胞浸润。
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AIM2调控小胶质细胞炎症以预防实验性自身免疫性脑脊髓炎
AIM2 controls microglial inflammation to prevent experimental autoimmune encephalomyelitis
实验完整度
高包括EAE动物模型、骨髓嵌合小鼠、条件性敲除小鼠、原代小胶质细胞体外实验、微阵列分析及体内DNA-PK抑制剂治疗等多个独立证据层级，包含明确的功能验证和机制验证。
主要模型
MOG诱导的EAE小鼠模型（WT、AIM2−/−、ASC−/−、cGAS−/−、AIM2−/−cGAS−/−、AIM2fl/flCx3cr1-CreERT2等） 原代小胶质细胞 骨髓嵌合小鼠
重点核对
EAE诱导使用MOG35-55肽（300 μg/小鼠）和不同剂量结核分枝杆菌H37Ra（200或400 μg/小鼠） 百日咳毒素剂量为250 ng/小鼠，于免疫后第0天和第2天静脉注射 DNA-PK抑制剂NU7441给药剂量为10 mg/kg每日腹腔注射 小胶质细胞特异性敲除AIM2使用他莫昔芬（3 mg/天，连续5天腹腔注射） 微阵列分析使用Affymetrix Mouse Clariom S Array，差异基因筛选阈值FC>1.2且P<0.05
摘要
PYHIN家族成员黑色素瘤缺失因子2（AIM2）作为另一个重要的炎症小体传感器，其在EAE中的作用仍不清楚。在本研究中，我们发现AIM2以不依赖炎症小体激活的方式负向调控EAE的发病。AIM2缺陷增强了小胶质细胞活化和外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润，从而促进EAE期间的神经炎症和脱髓鞘。机制上，AIM2在小胶质细胞中负向调控DNA-PK–AKT3，以控制由cGAS和DNA-PK协同诱导的神经炎症。给予DNA-PK抑制剂可减轻EAE的严重程度。总之，这些发现确定了AIM2在控制EAE发病中的新作用。此外，对潜在的不依赖炎症小体的机制的阐述，强调了cGAS和DNA-PK信号作为治疗异质性MS的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AIM2在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病中的作用及其不依赖炎症小体的潜在机制是什么？
- 核心机制
- AIM2在小胶质细胞中与DNA-PK相互作用，阻断DNA-PK与AKT3的结合，从而抑制AKT3激活及下游IRF3 Ser385磷酸化，进而抑制cGAS和DNA-PK协同诱导的IRF3激活和炎性细胞因子转录，最终抑制神经炎症和EAE发病。
- 主要证据
- AIM2缺陷加剧EAE临床评分和中枢神经系统免疫细胞浸润；骨髓嵌合实验和条件性敲除小鼠证明小胶质细胞AIM2是关键；原代小胶质细胞实验证实AIM2抑制DNA-PK–AKT3轴；AIM2−/−cGAS−/−小鼠和DNA-PK抑制剂治疗实验证实cGAS和DNA-PK信号参与。
- 研究意义
- 研究揭示AIM2在EAE中的非炎症小体依赖的保护作用，为异质性MS的治疗提供了靶向cGAS和DNA-PK信号的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞特异性敲除验证
确定AIM2在哪种细胞类型中发挥保护作用
利用骨髓嵌合小鼠和条件性敲除小鼠（Cx3cr1-CreERT2、GFAP-Cre）评估AIM2在外周免疫细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中的作用。
小胶质细胞转录组分析
鉴定AIM2调控的小胶质细胞基因和通路
分选EAE小鼠CNS中CD45lowCD11b+小胶质细胞，进行微阵列分析、KEGG通路分析和GSEA分析。
体外验证信号轴
验证AIM2调控DNA-PK–AKT3轴及抗病毒炎症反应
用poly(dA:dT)转染原代小胶质细胞，检测下游信号分子磷酸化水平和炎性细胞因子产生，并使用DNA-PK抑制剂NU7441和siRNA技术进行干预。
体内遗传和药理学验证
证实cGAS和DNA-PK信号在AIM2调控EAE中的作用
使用AIM2−/−cGAS−/−双敲除小鼠和DNA-PK抑制剂NU7441（10 mg/kg腹腔注射）评估EAE临床评分和病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55肽 | Sangon Biotech | -- |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | #180 | |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5506 | |
| 小胶质细胞培养与处理 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| poly(dA:dT)（poly(脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸)） | -- | -- | |
| NU7441 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA（siAKT1、siAKT2、siAKT3） | GenePharma | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| SYBR Green Supermix | Vazyme | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY410 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY406 | |
| CCL5 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY478 | |
| CXCL10 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY466 | |
| CCL2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY479 | |
| IFN-β ELISA捕获抗体 | Santa Cruz | sc-57201 | |
| IFN-β检测抗体 | R&D Systems | 32400-1 | |
| IFN-β标准蛋白 | R&D Systems | 12400-1 | |
| 免疫沉淀 | 抗DNA-PK抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4502385 |
| 抗AKT3抗体 | Cell Signaling Technology | 14982s | |
| 免疫印迹 | 抗AIM2抗体 | Cell Signaling Technology | 13095s |
| 抗p-IRF3-S396抗体 | Cell Signaling Technology | 4947s | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302s | |
| 抗p-TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483s | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013s | |
| 抗p-AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9018s | |
| 抗AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 2938s | |
| 抗p-AKT2抗体 | Cell Signaling Technology | 8599s | |
| 抗AKT2抗体 | Cell Signaling Technology | 3063s | |
| 抗p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060P | |
| 抗AKT3抗体 | Cell Signaling Technology | 14982s | |
| 抗p-IRF3-S385抗体 | Sangon Biotech | D151514 | |
| 抗Iba1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| 抗Apoe抗体 | Abcam | ab1906 | |
| 抗γH2AX抗体 | Abcam | ab11174 | |
| 流式分析 | 抗CD11b抗体 | Biolegend | 101204 |
| 免疫印迹 | 抗AKT抗体 | SAB | 21054 |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A1978 | |
| 流式分析 | 抗CD45-FITC抗体 | eBioscience | 11-0451-82 |
| 抗CD45-Alexa Fluor 700抗体 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| 抗CD8a-PE抗体 | eBioscience | 12-0081-83 | |
| 抗CD11b-APC抗体 | eBioscience | 17-0112-82 | |
| 抗IL17-PE抗体 | eBioscience | 12-7177-81 | |
| 抗IFNγ-PerCP-Cyanine5.5抗体 | eBioscience | 85-45-7311-82 | |
| 抗IFNγ-APC抗体 | eBioscience | 17-7311-82 | |
| 可固定活力染料eFluor 506 | eBioscience | -- | |
| 组织学分析 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| ProLong抗淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| RNA原位杂交试剂盒 | Servicebio | G3017 | |
| CNS免疫细胞分离 | 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Percoll密度梯度 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞内细胞因子染色 | 佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Multi Sciences | -- |
| 离子霉素 | Multi Sciences | -- | |
| 布雷菲德菌素A | Invitrogen | -- | |
| 细胞内固定与透化缓冲液套装 | eBioscience | -- | |
| 免疫沉淀 | NP-40裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白A/G-琼脂糖 | -- | -- | |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FlowJo 10.0.7软件 | -- | -- | |
| FACS分选 | BD FACS Aria流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 微阵列分析 | Affymetrix Mouse Clariom S芯片 | Affymetrix | -- |
| GeneChip Scanner 3000 7G扫描仪 | Affymetrix | -- | |
| GeneChip Command Console软件 | Affymetrix | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0软件 | -- | -- |
| 小胶质细胞培养 | 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- |
| 含FBS的HBSS | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 小鼠模型 | AIM2敲除小鼠 | -- | -- |
| ASC敲除小鼠 | -- | -- | |
| cGAS敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| AIM2条件敲除小鼠 | Biocytogen | -- | |
| Cx3cr1-Cre小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| GFAP-Cre小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| Cx3cr1-CreERT2-EYFP小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 微阵列分析 | Dr. Tom数据挖掘系统 | Beijing Genomics Institute | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55肽剂量（300 μg/小鼠），Mtb剂量（type A: 200 μg/小鼠；type B: 400 μg/小鼠），百日咳毒素剂量（250 ng/小鼠，第0和2天静脉注射），小鼠性别（雌性）和背景（C57BL/6） 阅读提示：Materials and methods: Induction and assessment of EAE |
| 小胶质细胞特异性敲除 | AIM2fl/flCx3cr1-CreERT2小鼠的他莫昔芬给药方案（3 mg/天，连续5天腹腔注射，6周后实验） 阅读提示：Materials and methods: Mice |
| 原代小胶质细胞处理 | poly(dA:dT)转染剂量（1 μg/10^6细胞），转染试剂Lipofectamine 2000浓度（2 μl/ml），刺激时间（4或8小时），NU7441浓度（1 nM）和预处理时间（1小时） 阅读提示：Materials and methods: Primary microglia culture; Figure 6 legends |
| 体内DNA-PK抑制 | NU7441给药剂量（10 mg/kg）和给药频率（每日），给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Results: Inhibition of the cGAS-DNA-PK axis rescues EAE pathogenesis in AIM2-deficient mice; Figure 7 legend |
| 微阵列分析 | 分选细胞类型（CD45lowCD11b+），分选时间（EAE免疫后第18天），芯片平台（Affymetrix Mouse Clariom S Array），差异基因筛选标准（FC>1.2且P<0.05） 阅读提示：Materials and methods: Microarray analysis |