受体表达筛选与功能验证
鉴定参与NK细胞抗肝纤维化功能的PG受体
利用BDL和CCL4小鼠模型，检测肝内NK细胞PG受体表达，并通过体外杀伤实验筛选影响NK细胞毒性的受体。
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EP3增强小鼠肝纤维化模型中NK细胞对肝星状细胞的粘附与细胞毒性
EP3 enhances adhesion and cytotoxicity of NK cells toward hepatic stellate cells in a murine liver fibrosis model
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠模型（CCL4/BDL诱导）、基因敲除/过表达、单细胞测序及患者样本等多层级验证。
主要模型
小鼠原代NK细胞 NK-92MI人NK细胞系 小鼠CCL4诱导肝纤维化模型 小鼠BDL诱导肝纤维化模型 肝硬化患者外周血NK细胞
重点核对
NK细胞亚群分析（CD27/CD11b分型） EP3特异性敲除/过表达验证 Itga4/VCAM1粘附功能实验 CCL4/BDL诱导肝纤维化模型评估 EP3激动剂治疗实验
摘要
自然杀伤（NK）细胞通过抑制活化的肝星状细胞（HSC）群体在肝纤维化（LF）中表现出抗纤维化特性。前列腺素E2（PGE2）在先天性和适应性免疫中发挥双重作用。在这里，我们发现E-前列腺素3受体（EP3）在肝纤维化小鼠和肝硬化患者来源的NK细胞中显著下调。NK细胞特异性缺失EP3加剧了小鼠LF模型中的肝纤维化。EP3缺失选择性地降低了CD27+CD11b+双阳性（DP）NK亚群对活化HSC的细胞毒性。机制上，EP3缺失通过调节Itga4-VCAM1结合损害DP NK细胞对HSC的粘附和细胞毒性。EP3通过促进PKC介导的Spic在T191位点磷酸化从而促进Spic核转位，上调NK细胞中Itga4的表达。EP3激动剂硫前列酮减轻了CCL4诱导的小鼠肝纤维化。因此，EP3对于NK细胞对HSC的粘附和细胞毒性是必需的，并可能作为治疗LF的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EP3是否调控NK细胞对肝星状细胞的杀伤功能，从而影响肝纤维化进程？
- 核心机制
- EP3通过Ca2+/PKC途径磷酸化Spic（T191），促进其核转位，上调Itga4表达，增强DP NK细胞与HSC表面VCAM1的粘附，从而发挥抗纤维化作用。
- 主要证据
- EP3缺失加重CCL4/BDL诱导的肝纤维化，且DP NK细胞杀伤活性降低；过表达EP3则缓解纤维化，且依赖于Spic和Itga4/VCAM1途径。
- 研究意义
- EP3在NK细胞中的激活可能成为治疗肝纤维化的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内基因操作验证
验证EP3在NK细胞中的功能必要性
构建NK细胞特异性EP3敲除和过表达小鼠，评估肝纤维化程度。
NK亚群功能分析
确定EP3影响的NK细胞亚群
分析NK细胞发育亚群的比例和功能，特别是DP亚群。
分子机制解析
阐明EP3调控NK细胞粘附和细胞毒性的分子途径
通过scRNA-seq和SCENIC分析筛选转录因子，验证Spic和Itga4的作用，并研究PKC/Spic/Itga4信号通路。
药物治疗验证
评估EP3激动剂对肝纤维化的治疗效果
在CCL4诱导的肝纤维化小鼠中给予EP3激动剂硫前列酮，评估肝纤维化程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | SC-51322 | Cayman Chemical | 10010744 |
| PF-04418948 | Cayman Chemical | 15016 | |
| L-798,106 | Cayman Chemical | 11129 | |
| 硫前列酮 | Cayman Chemical | 14765 | |
| L161982 | Cayman Chemical | 10011565 | |
| SQ29548 | Cayman Chemical | 19025 | |
| CAY10441 | Cayman Chemical | 10005186 | |
| AL8810 | Cayman Chemical | 16735 | |
| BW A868C | Cayman Chemical | 12060 | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I3909 | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | 330779 | |
| CFDA-SE | DOJINDO Molecular Technology | 150347-59-4 | |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | 180 | |
| U73122 | MedChemExpress | HY-13419 | |
| 佛波酯 | MedChemExpress | HY-18739 | |
| 蜂毒肽 | MedChemExpress | HY-P0233 | |
| 渥曼青霉素 | MedChemExpress | HY-10197 | |
| 索曲他林 | Selleckchem | S2791 | |
| 鬼笔环肽 | Abcam | ab176753 | |
| Percoll | Solarbio | P8370 | |
| 细胞培养 | OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091155 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| LX-2 | Sigma-Aldrich | SCC064 | |
| EasySep小鼠NK细胞分离试剂盒 | Stem Cell | 19855 | |
| 马血清 | Gibco | 26050088 | |
| β-巯基乙醇 | Solarbio | M8211 | |
| 叶酸 | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| 肌醇 | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| 小鼠重组IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| GolgiStop | BD Biosciences | -- | |
| NK-92MI | Procell Life Science & Technology Co. | CL-0533 | |
| 转染 | TransIT-TKO转染试剂 | Mirus Bio | MIR2152 |
| SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L | Lonza | V4XC-1012 | |
| Amaxa Nucleofector II/2b | Mirusbio | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗CD3-APC-cy7抗体 | BioLegend | 100222 | |
| 抗NK1.1-BV421抗体 | BioLegend | 108732 | |
| 抗CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101206 | |
| 抗CD27-PE-cy7抗体 | BioLegend | 124216 | |
| 抗CD49a-APC抗体 | BioLegend | 142606 | |
| 抗CD49b-Percp-cy5.5抗体 | BioLegend | 108916 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | -- | |
| Cytoperm溶液 | BD Biosciences | -- | |
| 抗IFN-γ-APC抗体 | BioLegend | 505809 | |
| FlowJo8.3.3 | TreeStar | -- | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | -- | |
| 组织学分析 | Image-Pro Plus 4.5 | Media Cybernetics | -- |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biochemical Institute | A030-2-1 | |
| 免疫荧光 | 抗NKp46抗体 | eBioscience | 16-3351-81 |
| 抗Spic抗体 | Affinity | DF3350 | |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭剂（含DAPI） | Invitrogen | -- | |
| LSM 800激光共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 细胞毒性分析 | 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0017 |
| 粘附实验 | VCAM1-Fc重组蛋白 | R&D Systems | 643-VM |
| 纤连蛋白 | R&D Systems | 4305-FNB | |
| EnSpire 2300多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| RNA提取与PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green Universal PCR mix | Takara | -- | |
| Roche LightCycler 480仪器II | Roche | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗Spic抗体 | Affinity | DF3350 | |
| 抗α-SMA抗体 | Sigma-Aldrich | A5228 | |
| 抗Desmin抗体 | Abcam | ab32362 | |
| 抗胶原III抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗LaminB抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Abclonal | AC026 | |
| 抗磷酸化苏氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9386S | |
| 抗NKp46抗体 | Abclonal | A14499 | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗Itga4抗体 | Proteintech | 19676-1-AP | |
| HRP标记的二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Tanon成像系统 | Tanon | Tanon-5200Multi | |
| scRNA-seq | 10x Genomics平台 | 10x Genomics | -- |
| Single Cell 3 v2试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | CellRanger软件v3.0.0 | 10x Genomics | -- |
| Seurat | -- | -- | |
| SingleR | -- | -- | |
| Metascape | -- | -- | |
| DAVID | -- | -- | |
| JASPAR | -- | -- | |
| 基因集富集分析 | -- | -- | |
| SCENIC | -- | -- | |
| 统计 | Prism 5 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | CCL4诱导肝纤维化剂量：2 ml/kg体重，25% CCL4溶于矿物油，每周两次，持续4周；BDL手术操作及术后时间（15天） 阅读提示：Materials and methods - Rodent models of LF |
| NK细胞分离与培养 | NK细胞分离方法（EasySep试剂盒），培养条件（α-MEM+10%FBS+10%马血清等），细胞因子添加（IL-2） 阅读提示：Materials and methods - Cell isolation, culturing, and transfection |
| 细胞毒性实验 | 效靶比（10:1），共培养时间（6小时），检测方法（LDH释放） 阅读提示：Materials and methods - Cytotoxicity assay |
| 粘附实验 | 包被蛋白（VCAM1-Fc或fibronectin，浓度10 μg/ml），细胞标记（CFDA-SE），共培养时间（4小时） 阅读提示：Materials and methods - Adhesion assay |
| 基因操作 | 小鼠品系（EP3F/F、NKp46Cre等），siRNA序列，转染试剂及条件 阅读提示：Materials and methods - Animals and Cell isolation |