验证CAF分泌因子对MYC的调节作用
测试CAF条件培养基是否影响PDAC细胞中MYC蛋白水平。
用CAF CM处理PDAC细胞，通过Western blot和IF检测MYC水平。
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酸性成纤维细胞生长因子是胰腺癌中MYC微环境调节的基础
Acidic fibroblast growth factor underlies microenvironmental regulation of MYC in pancreatic cancer
实验完整度
高体外细胞实验、患者样本分析、异种移植和原位移植模型，以及ChIP-seq和功能验证（敲低、抑制剂、突变体）等，多层次验证FGF1调控MYC的机制。
主要模型
人PDAC细胞系MiaPaCa2、PSN1、Panc1、PA-TU-8988T 原代人PDAC CAFs 人胰腺星状细胞hPSC 小鼠原位移植模型（FC1199和FC1245细胞） 皮下异种移植模型（MiaPaCa2细胞）
重点核对
细胞模型中CAF条件培养基处理时间（3小时）及MYC蛋白水平变化 FGF1中和抗体及shRNA敲低对MYC诱导的抑制 FGFR抑制剂（PD173074, Debio 1347, BGJ398）对MYC稳定性的影响 AKT抑制剂（MK2206）和GSK-3β突变体对MYC调节的验证 体内实验中BGJ398和trametinib的剂量及给药方式
摘要
尽管MYC作为致癌RAS的效应子具有关键作用，但缺乏靶向RAS驱动癌症中MYC活性的策略。在肺癌和胰腺癌的基因工程小鼠模型中，致癌KRAS不足以驱动肿瘤发生，而适度MYC过表达的加入则驱动了强烈的肿瘤形成，表明RAS通路之外的机制在MYC调节和RAS驱动的肿瘤发生中发挥关键作用。在这里，我们显示源自癌症相关成纤维细胞（CAFs）的酸性成纤维细胞生长因子（FGF1）与癌细胞自主信号协同作用，增加MYC水平、启动子占据和活性。FGF1对于MYC蛋白稳定性的旁分泌调节是必要且充分的，通过AKT和GSK-3β信号传导增加MYC半衰期。患者标本显示基质CAF含量与肿瘤 compartments中的MYC蛋白水平之间存在强相关性，并确定CAFs是肿瘤微环境中FGF1的特异性来源。总之，我们的发现表明MYC受细胞自主和微环境信号的协调调节，并确定CAF衍生的FGF1是致癌转录的新型旁分泌调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胰腺癌中微环境信号如何调节MYC？
- 核心机制
- CAF来源的FGF1通过FGFR激活AKT和GSK-3β，抑制MYC T58磷酸化，从而稳定MYC蛋白并增强其活性。
- 主要证据
- CAF条件培养基提高MYC半衰期和启动子占据；FGF1敲低或FGFR抑制剂降低MYC水平；患者样本显示CAF密度与MYC水平相关；体内实验证实FGFR抑制降低MYC并抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 确立CAF来源FGF1作为MYC的旁分泌调节因子，为RAS/MYC驱动癌症提供潜在治疗策略（如FGFR抑制剂联合MEK抑制剂）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
患者样本分析CAF密度与MYC相关性
检查人类PDAC中CAF含量与MYC蛋白水平是否相关。
免疫组化染色KRT、αSMA和MYC，定量分析相关性。
鉴定CAF来源的关键因子FGF1
确定CAF分泌的哪种因子介导MYC上调。
比较CAF和hPSC的基因表达，筛选候选因子，用中和抗体和FGF1敲低验证。
验证FGF1-FGFR信号通路
测试FGF1是否通过FGFR激活AKT/GSK-3β来稳定MYC。
使用重组FGF1、FGFR抑制剂、AKT抑制剂和突变体检测信号通路分子变化。
ChIP-seq分析MYC基因组定位
检查CAF CM是否改变MYC在全基因组的结合位点。
对处理细胞进行MYC ChIP-seq，分析差异结合位点并验证。
体内模型验证FGF1/FGFR轴功能
在体内测试抑制FGF1/FGFR是否影响MYC水平和肿瘤生长。
皮下共移植PDAC细胞与FGF1敲低CAFs；原位移植后用FGFR抑制剂单独或联合MEK抑制剂处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 完全F培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 蛋白质提取 | NE-PER核和胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- |
| Western blot | Bis-Tris NuPAGE凝胶 | Invitrogen | -- |
| PVDF膜 | 文中未明确说明 | -- | |
| IRDye 700山羊抗兔IgG | LI-COR Biosciences | -- | |
| IRDye 800山羊抗小鼠IgG | LI-COR Biosciences | -- | |
| Western blot成像 | Odyssey CLx红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| Western blot定量 | Image Studio软件 | LI-COR Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Alexa Fluor偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织切片染色 | Aqua Block缓冲液 | Abcam | -- |
| FISH | ViewRNA组织原位杂交试剂盒（双通道） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FISH封片 | DAKO ultramount封片剂 | Agilent | -- |
| 显微镜 | Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| Zeiss Axio Scan自动载玻片扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| ChIP-seq | Diagenode Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| Illumina TruSeq ChIP文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| 实时荧光定量PCR | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | -- |
| SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | 人酸性FGF Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DFA00B |
| 慢病毒包装 | 慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2 | Addgene | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | -- |
| GloMax酶标仪 | Promega | -- | |
| 药物处理 | PD173074 | Selleck Chemicals | S1264 |
| NVP-BGJ398 | Selleck Chemicals | S2183 | |
| 曲美替尼 | MedChem Express | HY-10999A | |
| 重组人酸性FGF | Stem Cell Technologies | 78187.1 | |
| 皮下移植 | 基质胶 | BD Biosciences | 354248 |
| 抗体（免疫荧光） | 平滑肌肌动蛋白单克隆抗体 | Invitrogen | MA5-11547 |
| 抗c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| 抗c-Myc (pS62)抗体 | Abcam | ab185656 | |
| 抗体（免疫荧光和Western blot） | 抗c-Myc兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 |
| 抗体（免疫荧光） | 抗FGFR1 (磷酸化Y653)抗体 | Abcam | ab173305 |
| 抗体（免疫荧光和Western blot） | 抗FGF1抗体 | R&D Systems | AF232 |
| 抗体（免疫荧光） | FGFR1单克隆抗体 | Invitrogen | 13-3100 |
| NPM1单克隆抗体 | Invitrogen | 32-5200 | |
| 泛角蛋白小鼠单克隆抗体（Alexa Fluor 647偶联） | Cell Signaling Technology | 4528 | |
| 广谱角蛋白I/II型抗体混合物 | Thermo Fisher Scientific | MA5-13156 | |
| Western blot抗体 | 抗c-Myc (pT58)抗体 | Abcam | ab28842 |
| 磷酸化Akt (Ser473)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| Akt (pan)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 磷酸化GSK-3β (Ser9)抗体 | Cell Signaling Technology | 9336 | |
| GSK-3β兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9315 | |
| Lamin A/C小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4777 | |
| HSC 70小鼠抗体 | Selleck Chemicals | 7298 | |
| 中和抗体 | 人酸性FGF中和抗体 | R&D Systems | AF232 |
| 人碱性FGF中和抗体 | R&D Systems | AF232 | |
| 人FGF-7中和抗体 | R&D Systems | MAB251 | |
| 人IL-6中和抗体 | R&D Systems | MAB2061 | |
| 人HGF中和抗体 | R&D Systems | AB-294-NA | |
| 人PDGF-AA中和抗体 | R&D Systems | MAB221 | |
| 人PDGF-BB中和抗体 | R&D Systems | AB-220-NA | |
| 人/小鼠Wnt-3a中和抗体 | R&D Systems | MAB9025 | |
| 质粒 | HA-AKT显性负性突变体(K17M) | Addgene | 16243 |
| HA-GSK3β S9A质粒 | Addgene | 14754 | |
| SMARTvector慢病毒人shRNA构建体 | Dharmacon | 224940601, 225482233, 226573540, 228128665 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | PDAC细胞系（MiaPaCa2, PSN1, Panc1, PA-TU-8988T）和CAF的培养条件；CAF代数（≤7代，部分至20代）；hPSC来源 阅读提示：Materials and methods: Cell lines, Generation of human PDAC primary CAFs |
| CAF条件培养基制备 | 血清饥饿时间（48小时）；收集时间（48小时）；离心条件（300g，5分钟） 阅读提示：Materials and methods: CM treatments |
| Western blot | 亚细胞分离试剂（NE-PER）；裂解缓冲液；抗体浓度未明确说明 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| MYC稳定性检测 | CHX浓度（50 µg/ml）；处理时间（0-3小时）；放线菌素D浓度（5 µg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Cycloheximide chase, Actinomycin D chase |
| 中和抗体筛选 | 中和抗体种类和浓度未明确；室温孵育1小时 阅读提示：Materials and methods: Neutralizing antibody screen |
| 免疫荧光染色 | 固定时间（15分钟）；透化（0.1% Triton X-100，10分钟）；封闭（8% BSA，1小时）；一抗孵育（3小时）；二抗稀释（1:400） 阅读提示：Materials and methods: Immunostaining |
| ChIP-seq | 细胞处理（3小时）；甲醛固定（1%）；染色质片段大小（200-1000 bp）；抗体（MYC CST 9402，IgG对照）；测序平台（HiSeq 2500，单端100循环） 阅读提示：Materials and methods: ChIP-seq |
| 细胞增殖实验 | 细胞密度（2×10^3/孔）；血清饥饿（72小时）；处理（72小时）；检测试剂（CellTiter-Glo） 阅读提示：Materials and methods: Proliferation assay |
| 动物实验 | 小鼠品系和年龄（C57BL/6J 8周龄，NU/J）；细胞数量（原位移植10000个，皮下移植1×10^6细胞+5×10^5 CAF）；BGJ398剂量（50 mg/kg），trametinib剂量（1 mg/kg），给药方式（口服灌胃），治疗时间（9天） 阅读提示：Materials and methods: Orthotopic transplant/allograft model, Subcutaneous PDAC transplants |