单细胞转录组谱分析
获得人类回肠、结肠和直肠上皮细胞的单细胞转录组图谱，进行细胞类型注释。
从6名供体（每段2人）获取回肠、结肠和直肠上皮组织，经消化获得单细胞悬液，使用10X Genomics平台进行单细胞RNA-seq，共获得14,537个细胞的转录组数据；通过无监督聚类和标志基因表达鉴定细胞类型。
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单细胞转录组分析揭示人肠道中不同的营养吸收功能
Single-cell transcriptome analysis reveals differential nutrient absorption functions in human intestine
实验完整度
高包含单细胞转录组测序、qPCR、免疫荧光、免疫组化、smFISH、类器官功能实验及小鼠组织验证，覆盖多层级证据。
主要模型
人类回肠、结肠和直肠上皮细胞 回肠、结肠和直肠类器官 小鼠肠组织（C57BL/6和Lgr5-EGFP）
重点核对
单细胞RNA-seq数据集中包含来自6名供体的回肠、结肠和直肠样本，每段2个生物学重复 细胞类型注释使用的标志基因（如LGR5、KI67） NUSAP1和KI67共染色统计（n=17） 类器官营养吸收实验中添加的底物浓度（20 mM） 营养吸收实验中氨基酸、有机溶质和糖的检测时间（24小时）
摘要
肠道在营养消化和吸收、微生物防御和激素分泌中起着重要作用。虽然已经在小鼠肠道上皮中鉴定出主要的细胞类型，但人类肠道中细胞类型特异性标志物和功能分配在很大程度上是未知的。在这里，我们对来自人类回肠、结肠和直肠的14,537个上皮细胞进行的单细胞RNA-seq分析揭示了小肠和大肠中不同的营养吸收偏好，表明大肠中可能存在潘氏样细胞，并确定了人类瞬时扩增细胞和杯状细胞的潜在新标志基因。我们通过定量PCR、免疫荧光和功能分析验证了其中一些发现。此外，我们展示了人类和小鼠回肠细胞景观的共同和差异特征。因此，我们的数据为详细描述人类肠道细胞组成和功能奠定了基础，这将有助于更好地理解人类肠道疾病，如炎症性肠病和肠道肿瘤发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类肠道不同节段（回肠、结肠、直肠）上皮细胞的细胞组成和功能差异，特别是营养吸收偏好。
- 核心机制
- 小肠（回肠）富集脂质、胆汁盐、维生素和水吸收相关基因，大肠（结肠和直肠）富集金属离子和核苷酸吸收相关基因；大肠存在表达LYZ、EGF、Wnt3等维持Lgr5+干细胞龛的潘氏样细胞。
- 主要证据
- 基于14,537个人类肠道上皮细胞的单细胞RNA-seq数据，结合qPCR、免疫荧光、免疫组化和smFISH验证关键基因表达，并通过类器官功能实验验证氨基酸、糖和有机溶质吸收差异。
- 研究意义
- 为详细表征人类肠道细胞组成和功能提供资源，有助于理解炎症性肠病和肠道肿瘤发生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
营养吸收相关基因表达分析
比较不同肠段上皮细胞中营养吸收相关基因的表达差异。
对肠上皮细胞（特别是肠上皮细胞）中的代谢相关基因进行功能富集分析和SLC家族转运蛋白表达分析，比较回肠、结肠和直肠间的差异。
类器官营养吸收功能验证
验证不同肠段来源类器官在营养吸收上的功能差异。
从人类回肠、结肠和直肠生成类器官，进行氨基酸、糖和有机溶质的营养吸收实验，使用LC-MS检测培养基中底物浓度的变化。
免疫荧光和免疫组化验证标志基因
验证关键基因在蛋白水平的表达和定位。
对肠道组织切片进行免疫荧光染色（如LYZ、NUSAP1、ITLN1、TFF1等）和免疫组化染色，确认关键基因在特定细胞类型和肠段的表达。
单分子原位杂交验证
验证ITLN1和LYZ mRNA在肠道组织中的定位。
使用RNAscope技术对肠道组织切片进行smFISH，检测ITLN1和LYZ mRNA的表达。
人类与小鼠回肠转录组比较
比较人类和小鼠回肠上皮细胞的基因表达特征，揭示保守和差异的标记基因。
将人类回肠细胞（6,187个）与公开发表的小鼠回肠单细胞转录组数据（3,927个）合并，进行CCA整合和聚类分析，比较各细胞类型的表达谱。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离与分选 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| Tryple消化液 | Invitrogen | -- | |
| 细胞分选 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 荧光激活细胞分选 | BeckMan | -- | |
| 单细胞RNA测序 | 10X Genomics Chromium 单细胞3' 解决方案 | 10X Genomics | -- |
| Illumina Hiseq X Ten PE150测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光/免疫组化 | 振动切片机HM650 | Microm | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜FV3000 | Olympus | -- | |
| 免疫组化 | DAB底物 | Dako | -- |
| smFISH | RNAscope过氧化氢 | ACD | 322335 |
| RNAscope蛋白酶Plus | ACD | 322331 | |
| ITLN1探针 | ACD | 549701 | |
| LYZ探针 | ACD | 421441 | |
| Nikon 90i显微镜 | Nikon | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| Revertra Ace逆转录酶 | Toyobo | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Thermo Scientific | 12634028 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Scientific | 15140122 | |
| GlutaMAX-I添加剂 | Thermo Scientific | 35050061 | |
| N2添加剂 | Thermo Scientific | 17502048 | |
| B27添加剂 | Thermo Scientific | 17504044 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子 | Invitrogen | -- | |
| 头蛋白 | R&D | -- | |
| R-spondin1 | R&D | -- | |
| CHIR-99021 | Selleck | -- | |
| A-83-01 | Cayman | -- | |
| SB202190 | Selleck | -- | |
| 胃泌素 | Tocris | -- | |
| Y27632 | Enzo | -- | |
| 前列腺素E2 | Selleck | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 营养吸收实验 | 胆碱 | MACLIN | C805027 |
| 琥珀酸 | MACLIN | S817854 | |
| 柠檬酸 | MACLIN | C805019 | |
| 果糖 | Selleck | S5176 | |
| 半乳糖 | Selleck | S3849 | |
| 甘露糖 | Selleck | S5763 | |
| LC-MS分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 抗体 | 兔抗LYZ抗体 | Abcam | ab108508 |
| 小鼠抗MUC2抗体 | Abcam | ab11197 | |
| 兔抗NUSAP1抗体 | Proteintech | 12024-1-AP | |
| 小鼠抗Ki67抗体 | CST | 9449s | |
| 小鼠抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610182 | |
| 兔抗ITLN1抗体 | Proteintech | 11770-1-AP | |
| 兔抗TFF1抗体 | Proteintech | 13734-1-AP | |
| 兔抗APOB抗体 | Proteintech | 20578-1-AP | |
| 兔抗APOA4抗体 | Proteintech | 17996-1-AP | |
| 兔抗SLC26A2抗体 | Proteintech | 27759-1-AP | |
| 兔抗SCNN1B抗体 | Proteintech | 14134-1-AP | |
| 兔抗SLC35A1抗体 | Proteintech | 16342-1-AP | |
| 兔抗FABP6抗体 | Proteintech | 13781-1-AP | |
| 兔抗SLC38A1抗体 | Proteintech | 12039-1-AP | |
| 兔抗SLC44A1抗体 | Proteintech | 14687-1-AP | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | -- | -- |
| Lgr5-EGFP小鼠 | The Jackson Laboratory | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序 | 供体样本数：每段2个供体；细胞数：14,537；测序平台：10X Genomics；参考基因组：GRCh38；细胞过滤标准：基因数≤200或线粒体基因比例>50%的细胞被剔除；细胞类型注释标志基因 阅读提示：Materials and methods部分“Human intestine tissue collection and ethics statement”、“cDNA library construction and single-cell RNA-seq”、“Process and quality control of the single-cell RNA-seq data”及图1和图S1图注 |
| 类器官培养 | 类器官培养条件：Matrigel包被，培养基成分和浓度（EGF 50 ng/ml，Noggin 100 ng/ml，R-spondin1 500 ng/ml，CHIR-99021 5 μM，A-83-01 0.5 μM，SB202190 10 μM，Gastrin 1 nM，Y27632 10 μM，PGE2 2.5 μM，Nicotinamide 10 mM） 阅读提示：Materials and methods部分“Human intestinal organoid culture” |
| 营养吸收实验 | 底物浓度：氨基酸吸收实验未注明具体底物；胆碱、琥珀酸、柠檬酸、果糖、半乳糖、甘露糖均使用20 mM；检测时间：24小时；重复次数：至少三次独立实验 阅读提示：Materials and methods部分“Nutrient uptake assay”及“Statistical analysis” |
| 免疫荧光/免疫组化 | 抗体稀释比：如anti-LYZ 1:200，anti-NUSAP1 1:100；固定条件：4%甲醛2小时；切片厚度未明确说明；图像采集：共聚焦显微镜FV3000 阅读提示：Materials and methods部分“Antibodies”、“Immunofluorescence and immunohistochemistry” |
| 单分子原位杂交（smFISH） | 探针：ITLN1探针（549701）和LYZ探针（421441）；杂交时间：2小时；杂交温度：40°C；信号检测系统：RNAscope 阅读提示：Materials and methods部分“Single-molecule in situ hybridization (smFISH)” |