Notch1 O-GlcNAcylation drives tumor stemness and mechanoadaptation to a stiff microenvironment and promotes chordoma recurrence
研究包含临床组织样本分析、体外细胞实验（不同刚度基质培养、功能获得/敲除）、体内小鼠移植瘤模型，并通过Western blot、IP、质谱、ChIP-seq和多种抑制剂/激活剂进行了功能及机制验证。
人脊索瘤细胞系（MUG-Chor1、UM-Chor1、JHC7） 人原代髓核细胞 小鼠皮下移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 原发-复发配对脊索瘤临床样本
原发和复发脊索瘤临床配对样本中NICD1 O-GlcNAc水平、Notch活性、机械相关基因及干性基因的表达 不同刚度（3.2 kPa至57.6 kPa）聚丙烯酰胺凝胶或I型胶原凝胶培养对脊索瘤细胞死亡、机械重塑、Notch信号和干性的影响 NICD1 O-GlcNAc位点突变体（T2063A/T2090A/S2162A）对Notch信号活性、NICD1稳定性、机械适应、干性及体内成瘤的影响 EPHA2抑制剂（ALW II-41-27）、LYN抑制剂（bafetinib）或激酶激活剂（MLR-1023）、OGT抑制剂（OSMI-1、DON）或OGA抑制剂（PUGNAC）处理后，NICD1 O-GlcNAc、Notch活性及细胞功能的变化 MIR31缺失或过表达对LYN表达、NICD1 O-GlcNAc、Notch活性及肿瘤恶性行为的影响
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较原发和复发脊索瘤组织的机械特性、Notch信号活性和干性相关基因表达。
对6对配对的原发-复发脊索瘤样本进行mRNA微阵列分析和GO/KEGG富集分析；对9-10对样本进行qRT-PCR检测干性、机械和Notch相关基因；对20对样本进行IHC检测VCL、COL1A1、LYN、EPHA2 p-S897和LYN p-Y507；对87例患者样本进行IHC、Duolink PLA和qRT-PCR分析，并与生存数据关联。
探究不同基质刚度对脊索瘤细胞死亡、机械重塑、Notch信号和干性的影响。
将脊索瘤细胞培养在刚度范围从3.2 kPa到57.6 kPa的聚丙烯酰胺凝胶或I型胶原凝胶上，通过TUNEL检测细胞死亡，通过phalloidin染色和IF检测F-actin和VCL，通过qRT-PCR和WB检测相关基因和蛋白表达。
验证Notch信号激活是否足以促进脊索瘤细胞的机械重塑、干性获得和对僵硬微环境的耐受。
在脊索瘤细胞中过表达NICD1，检测细胞球形成能力、CD15+细胞比例、干细胞相关基因表达、应力纤维形成、VCL/局部黏附、细胞刚度，以及在僵硬基质上的细胞死亡；建立小鼠移植瘤模型观察成瘤能力和肿瘤生长。
确定NICD1是否发生O-GlcNAc修饰以及修饰位点，并验证其在Notch信号激活和脊索瘤恶性行为中的功能。
通过IP和Click-iT O-GlcNAc酶标记系统检测NICD1的O-GlcNAc修饰；通过质谱鉴定修饰位点（T1927、T1930、S1941、T2063、T2090、S2162、S2163、S2183）；构建T2063A/T2090A/S2162A突变体，比较WT和突变体在NICD1稳定性、转录活性、机械重塑和体内成瘤方面的差异；使用OGT抑制剂（OSMI-1、DON）和OGA抑制剂（PUGNAC）处理细胞，检测NICD1 O-GlcNAc、Notch活性和细胞死亡。
探究僵硬ECM如何通过LYN激活OGT并促进NICD1 O-GlcNAc修饰。
在不同刚度基质上培养细胞，检测LYN磷酸化、OGT与LYN的相互作用、OGT酪氨酸磷酸化（Y418和Y989）及其对OGT酶活性的影响；使用LYN激活剂MLR-1023或抑制剂bafetinib处理细胞，检测NICD1 O-GlcNAc、Notch活性、机械重塑和细胞死亡；在细胞中表达OGT突变体（Y418A/Y989A），验证其功能丧失。
验证EPHA2是否作为机械传感器介导僵硬ECM对LYN和OGT的激活。
在不同刚度基质上培养细胞，检测EPHA2 S897磷酸化、LYN磷酸化及EPHA2与LYN的相互作用；使用EPHA2抑制剂ALW II-41-27处理细胞，检测对LYN/OGT通路和NICD1 O-GlcNAc的影响；构建EPHA2 S897D持续激活突变体，观察对下游信号和功能的影响。
验证MIR31缺失是否通过上调LYN促进NICD1 O-GlcNAc和Notch信号。
通过FISH和qRT-PCR检测原发和复发肿瘤中MIR31基因组拷贝数和mRNA水平；通过荧光素酶报告基因验证miR-31与LYN 3'UTR的结合；在细胞中过表达或敲除miR-31，检测LYN表达、NICD1 O-GlcNAc、Notch活性以及细胞对高刚度的耐受和干性；建立皮下移植瘤模型，给予miR-31 agomir、顺铂及PUGNAC/GlcNAc处理，观察肿瘤生长。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| O-GlcNAc检测 | Click-iT O-GlcNAc酶标记系统 | Invitrogen | -- |
| Click-iT蛋白分析检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 糖基转移酶活性检测 | UDP-Glo糖基转移酶检测 | Promega | -- |
| Duolink PLA | Duolink邻位连接检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 抗O-GlcNAc抗体 | Abcam | ab2739 | |
| 免疫沉淀 | 抗剪切Notch1抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| 抗磷酸化酪氨酸抗体 | Abcam | ab10321 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| 抗OGT抗体 | Abcam | ab177941 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 抗LYN磷酸化Y507抗体 | Abcam | ab33914 | |
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 基质胶 | BD | 356234 | |
| 刚度基质制备 | 磺基-SANPAH | Sigma-Aldrich | -- |
| I型胶原蛋白 | -- | -- | |
| 胶原收缩检测 | 胶原收缩检测试剂盒 | Cell biolabs | -- |
| 药物处理 | PUGNAC | -- | -- |
| N-乙酰葡糖胺 | -- | -- | |
| DAPT | -- | -- | |
| OSMI-1 | -- | -- | |
| DON | -- | -- | |
| MLR-1023 | -- | -- | |
| 巴非替尼 | -- | -- | |
| ALW II-41-27 | -- | -- | |
| SMIFH2 | -- | -- | |
| 顺铂 | -- | -- | |
| miR-31激动剂 | -- | -- | |
| 机械拉伸 | CellTank系统 | CELL & FORCE, Hangzhou Surface Force Technology | -- |
| 显微镜 | 共聚焦显微镜 | Leica SP8 | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | 8.3.0 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：MUG-Chor1和UM-Chor1使用IMDM:RPMI-1640 (4:1)培养基、10% FBS和1% L-谷氨酰胺；JHC7使用DMEM:F12和10% FBS；293T细胞使用DMEM和10% FBS及1%青霉素/链霉素；人原代NP细胞使用ScienCell培养基 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 刚度基质实验 | 聚丙烯酰胺凝胶刚度梯度（3.2 kPa至57.6 kPa）制备和细胞培养时间（48小时/7天）；I型胶原凝胶浓度（4 mg/mL）和包埋方法 阅读提示：Methods: Cell culture on gel substrates with different stiffness; Supplemental Methods |
| 药物处理 | PUGNAC (50 μM, 24小时/48小时), GlcNAc (10 μM, 24小时/48小时), DAPT (20 μM), OSMI-1 (50 μM), DON, MLR-1023 (10 μM), bafetinib (10 nM), ALW II-41-27 (10 nM), SMIFH2 (5 μM, 48小时)的浓度和处理时间 阅读提示：Methods: Main text figure legends, Results sections |
| 体内实验 | BALB/c裸鼠性别、年龄（4-5周）、体重（12-14g）；接种细胞数（1×10^7）；肿瘤体积测量；药物剂量（PUGNAC 10 mg/kg, GlcNAc 10 mg/kg, DAPT 1 mg/kg, OSMI-1 1 mg/kg, 顺铂 4 mg/kg, miR-31 agomir 1 mg/mL）和治疗时间（6周） 阅读提示：Methods: Xenograft analysis; Figure legends 3G, 7J |
| 临床样本分析 | 样本配对数量和检测类型（6对mRNA微阵列, 10对qPCR, 20对IHC/Duolink, 87例患者队列）；IHC/Duolink的定量标准（中位数作为截断值） 阅读提示：Methods: Human chordoma tissues; Figure legends 1K, 2F-H, 7A-C |
