临床样本分析
评估CCL5在前列腺癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。
收集前列腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织、血液样本及转移淋巴结，检测CCL5表达水平，分析其与Gleason分级、转移和预后的关系。
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肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL5通过激活β-catenin/STAT3信号促进前列腺癌干细胞和转移
CCL5 derived from tumor-associated macrophages promotes prostate cancer stem cells and metastasis via activating β-catenin/STAT3 signaling
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（迁移、侵袭、EMT、干性）、RNA-seq和机制验证（CHIP、报告基因）、体内异种移植瘤和骨转移模型、临床样本分析及生物信息学分析，多个独立证据层级且包含功能与机制验证。
主要模型
前列腺癌细胞系DU145、PC3 THP1来源的TAMs NOD/SCID小鼠异种移植瘤模型 前列腺癌患者组织及血清样本 PC3-Luc细胞
重点核对
THP1单核细胞经100 ng/ml PMA处理24小时诱导分化为M0巨噬细胞，再经10 ng/ml IL-4处理72小时极化为M2型TAMs PC3-Luc细胞与TAMs或shCCL5-TAMs以1:3比例共注射于NOD/SCID小鼠胫骨区域 体内实验中每只小鼠注射3×10^6个PC3-Luc细胞和9×10^6个TAMs 动物实验每组n=6，共12只小鼠 CCL5处理浓度为40 ng/ml用于RNA-seq和多数体外功能实验
摘要
前列腺癌干细胞（PCSCs）在前列腺癌进展和转移中发挥关键作用，这仍然是成功治疗前列腺癌的障碍。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的免疫细胞群体。对PCSCs和TAMs之间相互作用和网络信号的系统研究可能有助于寻找抑制PCSCs和转移的关键靶点。在此，我们证明TAMs分泌的CCL5能显著促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）以及PCSCs的体外自我更新。QPCR筛选证实STAT3是前列腺癌细胞中CCL5处理后最显著的响应基因。RNA测序和机制探索进一步揭示，CCL5可通过激活β-catenin/STAT3信号促进PCSCs自我更新和前列腺癌转移。值得注意的是，TAMs中CCL5敲低不仅显著抑制前列腺癌异种移植瘤的生长和骨转移，还抑制了体内PCSCs的自我更新和成瘤性。最后，临床研究和生物信息学分析表明，CCL5高表达与前列腺癌患者的高Gleason分级、预后不良、转移以及PCSCs活性增加显著相关。总之，TAMs/CCL5可通过激活β-catenin/STAT3信号促进PCSCs自我更新和前列腺癌转移。本研究为开发TAMs/CCL5作为消除PCSCs和预防转移性前列腺癌的潜在分子靶点提供了新的依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TAMs分泌的CCL5是否以及如何促进前列腺癌干细胞（PCSCs）自我更新和前列腺癌转移？
- 核心机制
- TAMs分泌的CCL5与PCSCs表面的CCR5受体结合，上调β-catenin表达，β-catenin直接结合至STAT3启动子区域促进STAT3转录和激活，从而激活β-catenin/STAT3信号通路，促进PCSCs自我更新和前列腺癌转移。
- 主要证据
- 体外实验表明CCL5促进前列腺癌细胞迁移、侵袭、EMT和PCSCs自我更新；RNA-seq和CHIP实验揭示CCL5通过CCR5/β-catenin/STAT3通路发挥作用；体内实验显示TAMs中CCL5敲低抑制肿瘤生长、骨转移和PCSCs活性；临床样本分析显示CCL5高表达与不良预后和PCSCs活性增加相关。
- 研究意义
- 本研究揭示了TAMs/CCL5在促进PCSCs自我更新和前列腺癌转移中的调控机制，为开发TAMs/CCL5作为消除PCSCs和预防转移性前列腺癌的潜在分子靶点提供了依据，可能有助于前列腺癌预后预测和靶向治疗策略的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
验证CCL5对前列腺癌细胞迁移、侵袭、EMT和干性的影响。
使用重组人CCL5处理DU145和PC3细胞，检测增殖、克隆形成、迁移、侵袭、EMT标志物表达、干性标志物和成球能力。
机制研究
揭示CCL5促进PCSCs自我更新和转移的分子机制。
通过QPCR筛选STAT3作为关键基因，RNA-seq分析差异基因，CHIP验证β-catenin结合STAT3启动子，抑制剂和siRNA干预验证通路。
体内实验
验证TAMs分泌的CCL5在体内对肿瘤生长、骨转移和PCSCs活性的影响。
将PC3-Luc细胞与TAMs或shCCL5-TAMs共注射入NOD/SCID小鼠胫骨，监测肿瘤生长和骨转移，分析PCSCs亚群和成瘤性。
临床验证和生物信息学分析
评估CCL5与前列腺癌患者预后和PCSCs活性的相关性。
利用公共数据库（GSE6919等）和商业组织芯片分析CCL5与预后、干性基因的相关性，并免疫组化验证蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞极化 | 佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸盐 | Sigma-Aldrich | -- |
| 重组人IL-4 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞处理 | 重组人CCL5 | PeproTech | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- |
| 侵袭实验 | 基质胶 | Corning | 354248 |
| Transwell小室 | Millipore | -- | |
| QPCR | RNAiso Plus试剂 | TaKaRa | 9109 |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | RR047A | |
| SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | |
| ABI Quant Studio 7 Flex实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blotting | MMP2抗体 | Abclonal | A6247 |
| STAT3抗体 | Abclonal | A11216 | |
| p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| iNOS抗体 | Cell Signaling Technology | 39898 | |
| MMP9抗体 | Cell Signaling Technology | 13667 | |
| β-catenin抗体 | Proteintech | 17565-1-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| CCR5抗体 | Affinity Biosciences | AF6339 | |
| CCL5抗体 | Affinity Biosciences | AF5151 | |
| Arg1抗体 | Affinity Biosciences | DF6657 | |
| 转染 | 慢病毒荧光素酶质粒 | GeneCopoeia | LPP-Hluc-Lv201-100 |
| Vigenefection转染试剂 | Vigene Biosciences | FH880806 | |
| 巨噬细胞表型分析 | FITC标记F4/80抗体 | Santa Cruz | SC-71085 |
| PE标记CD163抗体 | eBioscience | 12-1639-42 | |
| PCSCs分析 | FITC标记CD44抗体 | BD Biosciences | 11-0441-82 |
| PE标记CD133抗体 | Biolegend | 372804 | |
| ALDEFLUOR干细胞鉴定试剂盒 | STEMCELL Technologies | 01700 | |
| PCSCs分选 | CD133磁珠试剂盒 | Miltenyi | 130-100-857 |
| ELISA | CCL5 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp | SEA116Hu |
| 免疫荧光 | β-catenin抗体（用于免疫荧光） | Cell Signaling Technology | 8480S |
| Alexa Fluor 555标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4413S | |
| DAPI染料 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CCL5抗体（用于免疫荧光） | Affinity | DF7427 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4412S | |
| LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫组化 | 免疫组化聚合物检测系统 | Zhongshanjinqiao Biotech | PV-9000 |
| STAT3抗体（用于免疫组化） | Proteintech | 60199-1-Ig | |
| CD133抗体（用于免疫组化） | Proteintech | 18470-1-AP | |
| ALDH1A1抗体 | Affinity | BF0220 | |
| 过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG | Zhongshanjinqiao Biotech | ZB-2307 | |
| HE染色 | BX53正置金相显微镜 | Olympus | -- |
| 组织芯片分析 | 人前列腺癌组织芯片 | Outdo Biotech | HProA180PG05 |
| CHIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2078 |
| 双荧光素酶报告基因 | Secrete-Pair双发光检测试剂盒 | GeneCopoeia | LF031 |
| 动物实验 | D-荧光素 | PerkinElmer | 122799 |
| IVIS Lumina XR活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和极化 | THP1单核细胞使用100 ng/ml PMA处理24小时，然后用10 ng/ml IL-4处理72小时极化为TAMs；验证M2标志物CD163和Arg1表达 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture and induction |
| 体外CCL5处理 | 重组人CCL5浓度：2.5-40 ng/ml用于增殖和克隆形成，20-40 ng/ml用于迁移、侵袭、成球和流式分析，40 ng/ml用于RNA-seq 阅读提示：Figure 2 legends 和 Materials and methods |
| 机制研究 | STAT3抑制剂cryptotanshinone (CTS)和β-catenin抑制剂XAV-939的使用浓度和处理时间 阅读提示：Figure 4 legends 和 Figure 5 legends，Materials and methods 未详细说明 |
| 体内实验 | 动物模型：4周龄NOD/SCID雄性小鼠，每只注射3×10^6 PC3-Luc细胞和9×10^6 TAMs，共接种于胫骨区域 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| 体内成像 | D-荧光素剂量150 mg/kg体重，注射后使用IVIS系统每周成像 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |