肌肉卫星细胞分离与培养
获取PAD患者缺血性和灌注性肌肉卫星细胞用于后续分析
从PAD患者手术中获取缺血性（胫骨前肌等）和灌注性（股外侧肌等）肌肉样本，采用序贯铺板和MACS分选CD56+细胞，免疫细胞化学确认肌源。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
转录组分析鉴定外周动脉疾病影响的缺血性肌肉卫星细胞中铁死亡相关基因特征——简要报告
Transcriptomic Profiling Identifies Ferroptosis-Related Gene Signatures in Ischemic Muscle Satellite Cells Affected by Peripheral Artery Disease-Brief Report
实验完整度
中包含scRNA-seq、蛋白检测、脂质过氧化测定、组织学验证等多层级实验，但缺乏体内功能验证，铁死亡机制验证不完整。
主要模型
PAD患者缺血性肌肉卫星细胞 PAD患者非缺血性（灌注）肌肉卫星细胞
重点核对
缺血性与灌注性肌肉卫星细胞来源（不同肌群）及样本量（N=4/组） 单细胞RNA测序平台及数据分析流程（10X Genomics, Seurat, UMAP） 铁死亡相关蛋白表达（TFRC, CISD1, HMGB1）检测方法 ferrostatin-1处理及脂质过氧化测定条件 组织学检测（普鲁士蓝、苏丹黑）样本分组（CLI, IC, 无PAD）
摘要
背景：我们假设外周动脉疾病（PAD）中肌肉卫星细胞的转录组分析将识别导致骨骼肌肌病的损伤相关通路。我们确定了铁死亡（一种由铁介导的脂质过氧化引起的程序性裂解性细胞死亡）作为其中一条通路的潜在作用。铁死亡在缺血性心肌中促进肌病，但在PAD中的作用尚不清楚。方法：在外科手术中获得外周动脉疾病供体的肌肉卫星细胞。使用10X Genomics®平台处理cDNA文库进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。基于转录组分析推断的通路确认蛋白表达。结果：对来自8个供体样本的超过25,000个细胞进行无监督聚类分析，产生了具有共享独特转录指纹的不同细胞群体。静息细胞在缺血性肌肉中减少，而肌成纤维细胞和凋亡细胞显著。差异基因表达显示，在缺血性PAD来源的细胞中，与铁转运和氧化应激相关的基因意外增加，而谷胱甘肽过氧化物酶4减少。危险信号HMGB1的释放与铁死亡标志物（包括表面转铁蛋白受体）相关，且在缺血中更高。此外，肌肉卫星细胞中的脂质过氧化受铁死亡抑制剂ferrostatin调节。组织学证实PAD受累肌肉中有铁沉积和脂褐素（一种铁死亡诱导剂）。结论：这是首次记录已知参与铁死亡的基因在PAD影响的人骨骼肌中差异表达。靶向铁死亡可能是减少PAD肌病的新治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外周动脉疾病中，缺血性肌肉卫星细胞的转录组变化是否涉及铁死亡通路，以及铁死亡是否在PAD肌病中起作用？
- 核心机制
- 缺血性PAD肌肉卫星细胞中，铁代谢和氧化应激基因（TFRC, FTH1, FTL, TXN）表达升高，GPX4表达降低，伴随HMGB1释放和脂质过氧化，提示铁死亡参与PAD肌病。
- 主要证据
- scRNA-seq显示缺血性PAD MuSC中TFRC、FTH1等表达升高，GPX4降低；蛋白检测证实TFRC增加、CISD1减少；HMGB1释放增加；脂质过氧化升高且受ferrostatin调节；组织学发现铁沉积和脂褐素。
- 研究意义
- 首次记录PAD受累肌肉中铁死亡相关基因差异表达，靶向铁死亡可能成为减少PAD肌病的新治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序及数据分析
无偏倚地分析缺血性vs灌注性MuSC的转录差异，鉴定新通路
对分选后的MuSC进行10X Genomics scRNA-seq，使用Seurat进行降维聚类，Monocle3进行拟时间轨迹分析，鉴定细胞亚群并比较差异表达基因。
蛋白表达验证
验证转录组推断的铁死亡相关蛋白变化
通过免疫荧光、Western blot和流式细胞术检测缺血性和灌注性MuSC中TFRC、CISD1表达；通过ELISA和Western blot检测HMGB1释放。
脂质过氧化检测及ferrostatin处理
评估缺血性MuSC的脂质过氧化水平及ferrostatin-1的调节作用
使用BODIPY 581/591探针检测氧化脂质，加入ferrostatin-1处理；同时用MDA试剂盒量化脂质过氧化产物。
细胞活力检测
评估铁死亡诱导剂和抑制剂对MuSC活力的影响
用piperazine erastin和ferrostatin处理细胞，通过CellTiter-Glo检测活力。
组织学分析
在PAD患者肌肉组织中检测铁沉积和脂褐素
对PAD和对照组的腓肠肌活检标本进行普鲁士蓝染色检测铁离子，苏丹黑染色检测脂褐素。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
脂质过氧化检测
细胞活力检测
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分选 | CD56磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-050-401 |
| MS分离柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| 免疫细胞化学 | 抗Pax7抗体 | Abcam | ab64159 |
| 单细胞测序 | 10X Genomics平台 | 10X Genomics | -- |
| 免疫荧光 | 抗TFR1抗体 | Invitrogen | 13-6800 |
| 抗CISD1抗体 | Invitrogen | 16006-1-AP | |
| 鬼笔环肽 | Abcam | ab176759 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Alexa Fluor二抗 | Abcam | ab150117 | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| 脂质过氧化检测 | Image-iT脂质过氧化传感器 | ThermoFisher | C10445 |
| 细胞活力检测 | LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher | L34957 |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7572 | |
| 脂质过氧化检测 | MDA检测（TBARS） | Cayman Chemical | 10009055 |
| 蛋白检测 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23209 |
| ELISA | HMGB1 ELISA试剂盒 | Novus Biologicals | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | ThermoFisher | D12345 |
| 细胞处理 | Ferrostatin-1 | Selleckchem | S7243 |
| 蛋白裂解 | 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Cell Signaling | 5872S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卫星细胞分离 | 缺血性和灌注性肌肉来源（具体肌群），样本量（N=4/组），分选方法（MACS、CD56磁珠） 阅读提示：Methods: MuSC harvest and isolation |
| 单细胞RNA测序 | 测序平台（10X Genomics、NextSeq500），细胞负载量（4×10^3），数据分析软件（Seurat 4.0）及参数（PCA、UMAP） 阅读提示：Methods: scRNA sequencing |
| 蛋白表达检测 | 抗体（TFR1、CISD1）的浓度和稀释度，细胞固定和透化步骤，成像系统及分析方法 阅读提示：Methods: Protein detection |
| 流式细胞术 | 细胞数量（100,000/孔），抗体浓度（1:250），流式细胞仪型号（BD LSRFortessa），荧光通道（510nm、590nm） 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 脂质过氧化检测 | Fer-1浓度（5 μM），BODIPY浓度（2 μM），阳性对照（cumene hydroperoxide 100 μM），处理时间（5小时），检测方法（荧光比值、MDA） 阅读提示：Methods: Flow cytometry, Malondialdohyde assay |
| HMGB1检测 | 细胞数量（100,000），培养氧浓度（20% vs 1%），ELISA试剂盒品牌（Novus Biologicals），上清收集时间（24小时） 阅读提示：Methods: HMGB1 ELISA |
| 细胞活力检测 | 细胞数量（15,000/孔），处理浓度（PE 5 μM、Fer-1 5 μM），处理时间（48小时），检测方法（CellTiter-Glo），重复数（triplicate） 阅读提示：Methods: Viability |
| 组织学分析 | 样本分组（CLI、IC、无PAD，每组N=10），染色方法（普鲁士蓝、苏丹黑），图像获取（100X），定量方法（Image J） 阅读提示：Methods: Sudan Black and Prussian Blue calf muscle histology |