筛选LSC富集RBP并设计体内CRISPR筛选
鉴定在LSC中富集且在正常LT-HSC中低表达的候选RBP，以构建体内筛选体系。
通过对78例AML患者的LSC+和LSC-亚群转录组数据进行GSEA，定义LSC富集RBP（LLE），并进一步筛选出128个候选RBP。设计靶向这些RBP的sgRNA库，构建Cas9表达的小鼠MLL-AF9/NrasG12D白血病模型（RN2c）。
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体内筛选揭示白血病干细胞中普遍存在的RNA结合蛋白依赖性，并确定ELAVL1为治疗靶点
In Vivo Screening Unveils Pervasive RNA-Binding Protein Dependencies in Leukemic Stem Cells and Identifies ELAVL1 as a Therapeutic Target
实验完整度
高包含体内CRISPR筛选、独立敲除验证、多组学分析、体外及体内功能实验、异种移植模型及患者样本等至少两个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
RN2c小鼠MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞 MLL-AF9小鼠白血病模型 bcCML小鼠白血病模型 人原代AML细胞异种移植模型（NSG小鼠）
重点核对
RN2c细胞中ELAVL1敲除或敲低后体内移植实验，观察白血病重建能力变化 MLL-AF9和bcCML小鼠模型中shElavl1感染后连续移植，评估LSC功能 人原代AML细胞中shELAVL1敲低后异种移植，检测CD45+CD33+细胞比例及绝对数量 MS-444处理（20 mg/kg，腹腔注射，每48小时一次，持续4周）对AML异种移植和CB移植小鼠的影响
摘要
急性髓系白血病（AML）由白血病干细胞（LSC）驱动，其决定因素难以与造血干细胞（HSC）区分，也难以通过关注一般细胞特性的方法揭示。我们已鉴定出一组在人类AML LSC中选择性富集的RNA结合蛋白（RBP）。利用体内两步CRISPR-Cas9筛选评估干细胞功能，我们在MLL-AF9;NrasG12D AML中发现了32个对LSC必需的RBP。针对关键命中RBP ELAVL1的功能缺失方法损害了LSC驱动的体内白血病重建，并选择性地耗竭原始恶性细胞而非健康细胞。整合多组学揭示分化、剪接和线粒体代谢是定义白血病ELAVL1–mRNA相互作用组的关键特征，其中线粒体输入蛋白TOMM34是ELAVL1直接稳定的靶标，其抑制损害AML增殖。总之，利用适应干细胞特性的体内CRISPR筛选，这项工作证明了LSC对RBP作为调节因子的普遍依赖性，并强调了其作为AML治疗靶点的潜力。意义：针对LSC的疗法仍是AML中未满足的重要需求。我们开发了一种适应干细胞特性的体内CRISPR筛选，以识别关键的LSC驱动因素。我们揭示了LSC中广泛的RNA结合蛋白依赖性，包括ELAVL1，我们将其确定为一个新的治疗脆弱点，通过其调节线粒体代谢实现。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些RNA结合蛋白是AML白血病干细胞功能所必需的，它们能否作为治疗靶点？
- 核心机制
- ELAVL1通过稳定其靶标mRNA（包括TOMM34）并调控剪接，维持LSC的线粒体代谢和功能，从而支持AML的存活与增殖。
- 主要证据
- 体内两步CRISPR筛选鉴定32个必需RBP；ELAVL1敲低或药物抑制损害LSC驱动的体内重建，并减少线粒体活性；eCLIP-seq和RNA-seq揭示ELAVL1直接结合并调控线粒体基因TOMM34；TOMM34敲低模拟ELAVL1缺失表型，其过表达部分挽救LSC缺陷。
- 研究意义
- 该研究首次系统揭示了AML LSC对RBP的广泛依赖性，并确定ELAVL1为新的治疗靶点，其抑制可选择性杀伤LSC而保留正常HSC，为AML治疗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内两步移植CRISPR dropout筛选
通过连续移植评估候选RBP对LSC重建和自我更新的功能需求。
将携带sgRNA文库的RN2c细胞移植到亚致死辐照小鼠体内，进行原代和继代移植，通过测序分析sgRNA丰度变化，筛选在体内强烈缺失的RBP。
独立验证筛选命中基因的功能
确认单个sgRNA敲除对体内白血病生长和LSC频率的影响与筛选结果一致。
针对选定的原代和继代命中基因（包括ELAVL1）设计单个sgRNA，感染RN2c细胞后移植，评估H2B-GFP+细胞比例变化和cKit+ LSC富集群的变化。
ELAVL1缺失对LSC功能的影响
在多种小鼠白血病模型和人原代AML中验证ELAVL1缺失对LSC自我更新和体内增殖的作用，并评估对正常造血干细胞的影响。
使用shRNA敲低ELAVL1，在MLL-AF9和bcCML模型中进行连续移植实验，检测白血病进展、cKit+ LSC群和细胞凋亡；在人原代AML中进行异种移植实验，评估CD45+CD33+细胞比例和绝对数；同时在人脐带血移植模型中评估对正常HSC的影响。
ELAVL1靶基因和机制的多组学分析
鉴定ELAVL1的直接RNA靶标并解析其调控网络，以阐明其支持LSC的机制。
对ELAVL1敲除的RN2c细胞进行RNA-seq和eCLIP-seq，鉴定ELAVL1结合的转录本和差异表达基因；通过整合分析发现ELAVL1直接调控线粒体基因TOMM34，并影响剪接和RNA稳定性。
小分子抑制ELAVL1的体内外效应
评估小分子抑制剂DHTS和MS-444对AML细胞和异种移植模型的影响，并验证其对LSC的特异性。
用DHTS处理人原代AML细胞，检测分化、凋亡和集落形成；用MS-444处理原代AML细胞，检测分化、凋亡；并进行体内异种移植，给予MS-444后分析白血病负荷和LSC频率。
验证TOMM34作为ELAVL1下游效应分子
验证TOMM34是否为ELAVL1的直接下游靶标，并介导其维持线粒体功能和LSC的作用。
在人类原代AML细胞中敲低TOMM34，检测增殖、分化、凋亡和线粒体活性；在OCI-AML-22细胞中同时过表达TOMM34和敲低ELAVL1，观察LSC亚群的比例变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
RNA-蛋白互作分析
线粒体功能分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠处理与移植 | B6.SJL小鼠 | -- | IMSR_JAX:002014 |
| C57Blk/6小鼠 | -- | IMSR_JAX:000664 | |
| NSG小鼠 | -- | IMSR_JAX:005557 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| SFEM培养基 | STEMCELL Technologies | 09650 | |
| 细胞因子 | 小鼠干细胞因子 | R&D Systems | 455-MC-010 |
| 小鼠白细胞介素3 | R&D Systems | 403-ML-050 | |
| 小鼠白细胞介素6 | R&D Systems | 406-ML-025 | |
| 人干细胞因子 | R&D Systems | 255-SC-050 | |
| 人白细胞介素3 | R&D Systems | 203-IL-050 | |
| 人白细胞介素6 | PeproTech | AF-200-06 | |
| 人促血小板生成素 | PeproTech | AF-300-18 | |
| 人FMS样酪氨酸激酶3配体 | R&D Systems | 308-FKN-100 | |
| 小鼠促血小板生成素 | PeproTech | AF-315-14 | |
| 细胞分离 | Ficoll-Paque PREMIUM密度梯度分离液 | Cytiva | 17544203 |
| 氯化铵裂解液 | STEMCELL Technologies | 07850 | |
| EasySep免疫磁性分离柱 | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| 细胞培养 | BIT血清替代物 | STEMCELL Technologies | 09500 |
| StemSpan SFEM II培养基 | STEMCELL Technologies | 09655 | |
| X-VIVO培养基 | Lonza | BEBP04-743Q | |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| 药物处理 | 二氢丹参酮I | MilliporeSigma | D0947-10MG |
| MS-444 | MedChemExpress | HY-100685 | |
| 流式细胞术 | 7-AAD染液 | BD Biosciences | 559925 |
| 膜联蛋白V | BD Biosciences | 563544 | |
| CD45抗体 | BD Biosciences | 563879 | |
| CD33抗体 | BD Biosciences | 347787 | |
| CD14抗体 | BD Biosciences | 561385 | |
| CD11b抗体 | BD Biosciences | 562721 | |
| Live/Dead可固定染料 | Thermo Fisher Scientific | L34959 | |
| MitoTracker实验 | MitoTracker Orange CMTMRos | Thermo Fisher Scientific | M7510 |
| FCCP | Cayman Chemicals | 15218 | |
| RNA-seq | TRIzol LS试剂 | Thermo Fisher Scientific | 10296028 |
| NEBNext PolyA mRNA磁分离模块 | NEB | E7490 | |
| NEBNext Ultra II 方向性RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7760L | |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina） | NEB | E6440L | |
| eCLIP-seq | 抗ELAVL1小鼠单克隆IgG | Abcam | ab170193 |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | MilliporeSigma | A5441 |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | MilliporeSigma | H9268 |
| 质粒构建 | BsmBI限制酶 | NEB | R0580S |
| pLKO1-CRISPR-H2B-GFP载体 | -- | -- | |
| Stbl4电转感受态细胞 | Thermo Fisher Scientific | 11635018 | |
| PureLink HiPure质粒大提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K210007 | |
| 慢病毒生产 | pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| qRT-PCR | qScript cDNA合成试剂盒 | Quanta Biosciences | 95048-100 |
| PerfeCTa qPCR预混液（低ROX） | Quanta Biosciences | 95052-500 | |
| 通用探针库 | Roche | -- | |
| 免疫荧光 | 抗G3BP1抗体 | Proteintech | 13057-2-AP |
| DAPI染液 | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Fluoromount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 细胞分选 | MoFlo XDP流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
| 集落形成实验 | Methocult甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | M3434 |
| Colony Gel集落形成培养基 | ReachBio | 1102 | |
| 细胞分离 | 谱系细胞去除抗体混合物 | STEMCELL Technologies | 19356 |
| EasySep小鼠祖细胞富集抗体混合物 | STEMCELL Technologies | 19856 | |
| RNA提取 | PicoPure RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 |
| RNA-seq | Nextera DNA文库制备试剂盒 | Illumina | FC-121-1031 |
| eCLIP-seq | RNase I | NEB | M0314L |
| M-280羊抗小鼠IgG磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11201D | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201L | |
| T4 RNA连接酶 | NEB | M0437M | |
| AffinityScript逆转录酶 | Agilent | -- | |
| RNA-seq | GlycoBlue共沉淀剂 | Thermo Fisher Scientific | AM9516 |
| DNA酶I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| TURBO DNA-free试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | |
| RNA提取 | Phasemaker离心管 | Thermo Fisher Scientific | A33248 |
| 流式细胞术 | SYTOX Blue死细胞染色 | Thermo Fisher Scientific | S34857 |
| Western blot | 抗TOMM34兔多克隆抗体 | Abcam | ab230103 |
| 抗α-微管蛋白兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technologies | 2125S | |
| IRDye 680RD羊抗兔IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 800CW羊抗鼠IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | |
| 免疫荧光 | AlexaFluor-647驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A21235 |
| AlexaFluor-488驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| 流式细胞术 | MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- |
| BD LSRII分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| 显微镜 | Olympus IX81显微镜 | Olympus | -- |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
| MATLAB软件 | The MathWorks Inc | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内CRISPR筛选 | RN2c细胞状态、sgRNA文库覆盖度、移植细胞数量、移植时间点、MAGeCK分析参数 阅读提示：方法：In Vivo Pooled Dropout Screen Transduction and Transplantation；结果：图1E-H |
| ELAVL1敲低验证 | shRNA序列、慢病毒感染MOI、移植细胞剂量、受体小鼠品系及辐照剂量、移植后时间点 阅读提示：方法：Lentiviral-Infected and DHTS-Treated Primary AML Transplantation Assays；MLL-AF9 and bcCML Infections and Transplants |
| 药物处理 | DHTS和MS-444的浓度、处理时间、给药途径、给药频率、给药周期 阅读提示：方法：Primary AML Immunophenotyping and Apoptosis；结果：图5G |
| 多组学分析 | RN2c和bcCML细胞的培养状态、eCLIP-seq和RNA-seq的建库方法、测序深度、数据分析流程 阅读提示：方法：Enhanced Cross-linking and Immunoprecipitation；RNA-seq of RN2c Cells；RNA-seq of Primary AML Cells |