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        MET诱导的CD73抑制EGFR突变肺癌中STING介导的免疫原性

        MET-Induced CD73 Restrains STING-Mediated Immunogenicity of EGFR-Mutant Lung Cancer

        作者信息Ryohei Yoshida, Maria Saigi, Tetsuo Tani, Benjamin F Springer, Hirofumi Shibata, Shunsuke Kitajima, Navin R Mahadevan, Marco Campisi, William Kim, Yoshihisa Kobayashi, Tran C Thai, Koji Haratani, Yurie Yamamoto, Shriram K Sundararaman, Erik H Knelson, Amir Vajdi, Israel Canadas, Ravindra Uppaluri, Cloud P Paweletz, Juan J Miret, Patrick H Lizotte, Prafulla C Gokhale, Pasi A Jänne, David A Barbie
        PMID36066413
        期刊Cancer Res
        发布时间2022-11
        DOI10.1158/0008-5472.CAN-22-0770
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        研究包含细胞系模型、CRISPR敲除/过表达、流式、免疫印迹、类器官/PDX、免疫组化、人源化小鼠模型、抗原特异性T细胞模型等多种独立证据层级，并进行功能验证和机制验证

        主要模型

        HCC827/HCC827GR6肺癌细胞系 HCC827GR6异种移植人源化小鼠模型 J76 TCR-LMP2B T细胞抗原识别模型 EGFR突变肺癌PDX组织样本

        重点核对

        HCC827GR6细胞系（MET扩增） CD73敲除（CRISPR/Cas9） PEM（培美曲塞）处理 STING/cGAS敲除 HLA-A*11:01肽段（SSCSSCPLSK）

        摘要

        免疫治疗在EGFR突变肺癌患者中效果有限。迄今为止，增强EGFR突变肺癌免疫原性的努力尚未成功。在这里，我们发现MET扩增（第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）最常见的耐药机制）激活肿瘤细胞STING，这是癌症免疫原性的新兴决定因素。然而，STING激活受到外核苷酸酶CD73的限制，CD73在MET扩增的EGFR-TKI耐药细胞中被诱导。系统的基因组分析和细胞系研究证实，在MET扩增和MET激活的肺癌环境中CD73上调，这依赖于FOSL1的共诱导。培美曲塞（PEM）是EGFR-TKI治疗失败后常用的药物，被确定为MET扩增的EGFR-TKI耐药细胞中STING依赖性TBK1-IRF3-STAT1信号传导的有效增强剂。然而，PEM治疗也诱导腺苷产生，抑制T细胞反应。在同种异体人源化小鼠模型中，CD73缺失增强了MET扩增的EGFR-TKI耐药细胞的免疫原性，PEM治疗促进了强健的反应，无论CD73状态如何。使用生理性抗原识别模型，CD73失活显著增加了PEM治疗后抗原特异性CD8+ T细胞的免疫原性。这些数据表明，PEM联合CD73抑制可协同利用TKI耐药的EGFR突变肺癌中的肿瘤细胞STING诱导并促进免疫原性。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        MET扩增的EGFR-TKI耐药肺癌细胞中高表达STING，但免疫原性受到抑制的原因及如何增强其免疫原性？
        核心机制
        MET扩增经FOSL1上调CD73，CD73产生腺苷抑制STING驱动的免疫原性；培美曲塞通过激活cGAS-STING通路增强TBK1-IRF3-STAT1信号传导，诱导趋化因子和HLA-I表达，而CD73抑制可解除其对T细胞活化的抑制。
        主要证据
        HCC827GR6细胞中MET和STING表达相关，CD73高表达，PEM激活STING和I型干扰素反应；在人源化小鼠模型中，CD73敲除减慢肿瘤生长并增强CD8+ T细胞浸润，PEM处理后肿瘤消退；抗原特异性模型中CD73敲除增加IFNγ和IL2产生。
        研究意义
        该研究提出联合MET扩增的EGFR-TKI耐药肺癌中PEM和CD73抑制可增强肿瘤免疫原性，为改善该类患者免疫治疗疗效提供策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        MET驱动EGFR-TKI耐药与STING诱导相关性验证

        验证MET扩增是否诱导STING表达

        比较HCC827亲本和耐药细胞（HCC827GR6、HCC827EPR）中STING表达，并用savolitinib处理、MET敲除或过表达检测STING水平。

        2

        MET调控STING下游信号通路验证

        验证MET/STING对dsDNA诱导的TBK1-IRF3-STAT1信号和CXCL10分泌的影响

        使用poly(dA:dT)或2'3'-cGAMP刺激，检测pTBK1、pIRF3、pSTAT1水平和CXCL10分泌。

        3

        CD73与STING共表达验证

        验证MET扩增是否同时上调CD73

        分析TCGA和CCLE数据库，使用免疫印迹和流式细胞术检测CD73表达，并通过MET敲除或过表达验证。

        4

        CD73调控机制验证

        验证MET通过FRA1调控CD73

        检测FRA1表达，通过FRA1过表达或敲除观察CD73变化。

        5

        PEM激活STING通路验证

        筛选能激活STING的化疗药物并验证PEM特异性效应

        多种化疗药物处理HCC827GR6细胞，检测CXCL10、cGAMP、pTBK1/pIRF3/pSTAT1，并验证STING或cGAS敲除的影响。

        6

        体内免疫原性评估

        在体内模型中验证CD73缺失和PEM对免疫原性和肿瘤生长的影响

        在人源化小鼠中植入HCC827GR6（对照或CD73 KO），监测肿瘤生长，并用PEM处理，分析CD8+ T细胞浸润。

        7

        抗原特异性T细胞识别验证

        验证CD73抑制和PEM对T细胞活化的协同作用

        使用J76 TCR-LMP2B细胞与肿瘤细胞共培养，检测IFNγ和IL2产生。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫组织化学流式细胞术
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时荧光定量PCR
        验证功能变化
        细胞活力检测酶联免疫吸附测定
        验证机制链路
        CRISPR/Cas9基因敲除过表达siRNA敲低
        评估体内效果
        人源化小鼠模型肿瘤生长监测
        数据分析与统计
        RNA测序分析统计分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基Thermo Fisher Scientific11965-118
        RPMI1640培养基Thermo Fisher Scientific11875-119
        胎牛血清GeminiBio products100-106
        青霉素/链霉素Gibco15140-122
        药物处理奥希替尼SelleckchemS7297
        萨沃替尼SelleckchemS7674
        培美曲塞SelleckchemS5971
        多西他赛SelleckchemS1148
        长春瑞滨SelleckchemS4269
        依托泊苷SelleckchemS1225
        奥拉帕尼SelleckchemS1060
        巴瑞替尼SelleckchemS1147
        顺铂SelleckchemS1166
        鲁索替尼SelleckchemS1378
        曲美替尼SelleckchemS2673
        克唑替尼SelleckchemS1068
        AB680MedChemExpressHY-125286
        腺苷Sigma-AldrichA9251
        一磷酸腺苷Sigma-AldrichA1752
        APCPSigma-AldrichM8386
        重组人肝细胞生长因子R&D Systems294-HG-005/CF
        免疫组织化学STING抗体Cell Signaling Technology13647
        CD73抗体Cell Signaling Technology13160
        c-MET抗体Abcamab243930
        Bond聚合物精制检测试剂盒Leica BiosystemsDC9800
        CRISPR/Cas9X-tremeGENE HP DNA转染试剂Roche06366236001
        Lenti-X浓缩器Clontech631231
        qRT-PCRRNeasy Mini试剂盒Qiagen74106
        SuperScript III第一链合成SuperMixThermo Fisher Scientific1683483
        Power SYBR Green PCR预混液Thermo Fisher Scientific4367659
        免疫印迹RIPA裂解和提取缓冲液Thermo Fisher Scientific89900
        蛋白酶抑制剂Roche11-836-145-001
        MET抗体Cell Signaling Technology8198
        磷酸化MET抗体Cell Signaling Technology3077
        TBK1抗体Cell Signaling Technology3013
        磷酸化TBK1抗体Cell Signaling Technology5483
        IRF3抗体Cell Signaling Technology11904
        磷酸化IRF3抗体Cell Signaling Technology4947
        STAT1抗体Cell Signaling Technology9172
        磷酸化STAT1抗体Cell Signaling Technology9167
        ERK抗体Cell Signaling Technology9107
        磷酸化ERK抗体Cell Signaling Technology4370
        AKT抗体Cell Signaling Technology9272
        磷酸化AKT抗体Cell Signaling Technology4060
        FRA1抗体Abcam124722
        磷酸化FRA1抗体Cell Signaling Technology5841
        cGAS抗体Cell Signaling Technology15102
        β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology3700
        IRDye 680LT山羊抗小鼠IgGLI-COR Bioscience926-68020
        IRDye 800CW山羊抗兔IgGLI-COR Bioscience926-32211
        流式细胞术抗HLA-A,B,C抗体BioLegend311436
        抗CD73抗体BioLegend344004
        抗CD39抗体R&D SystemsFAB4397A
        抗PD-L1抗体BioLegend329718
        抗CD45抗体BioLegend368511
        同型IgG对照抗体BioLegend400268
        LMP2四聚体-SSCSSCPLSKMBL--
        细胞活力检测CellTiter-Glo发光细胞活力检测Promega--
        腺苷检测腺苷检测试剂盒Abcamab211094
        dsDNA刺激poly(dA:dT)Invivogentlrl-patn
        siRNA转染靶向MET的siRNAThermo Fisher Scientifics8702
        阴性对照siRNAThermo Fisher Scientific4390843
        Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778030
        ELISA人CXCL10 ELISAR&D SystemsDIP100
        人IFNγ ELISAR&D SystemsDIF50C
        人IL2 ELISAR&D SystemsD2050
        动物实验NSG小鼠The Jackson Laboratory--
        CD34+细胞HumanCells Bioscience--
        基质胶Thermo Fisher Scientific--
        IV型胶原酶Life Technologies--
        脱氧核糖核酸酶IRoche--
        红细胞裂解液BioLegend--
        Live/Dead Zombie NIRBioLegend--
        人和小鼠TruStain FcX阻断试剂BioLegend--
        CD16抗体BioLegend302006
        CD8抗体Thermo Fisher ScientificBDB560662
        CD56抗体BioLegend318348
        PD-L1抗体BioLegend329708
        CD3抗体BioLegend300424
        HLA-DR抗体Thermo Fisher ScientificBDB562804
        CD45RO抗体BioLegend304237
        CD15抗体BioLegend323028
        CD19抗体BioLegend302243
        CD4抗体BioLegend300554
        CD14抗体BioLegend301840

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养
        细胞系来源、培养基（DMEM、RPMI1640）、FBS浓度（10%）、青霉素/链霉素（1%）、培养温度（37°C）和CO2浓度（5%）
        阅读提示：Materials and Methods- Cell lines
        药物处理
        药物种类、浓度（如PEM、OSI、SAVO等），处理时间（48小时、72小时）
        阅读提示：Materials and Methods- Reagents and treatments
        CRISPR/Cas9敲除
        sgRNA序列，转染试剂（X-tremeGENE HP），质粒用量，筛选抗生素浓度（嘌呤霉素0.5-2 μg/mL，杀稻瘟菌素1.5-8 μg/mL）
        阅读提示：Materials and Methods- CRISPR/Cas9 system and lentiviral infection
        dsDNA刺激
        poly(dA:dT)浓度（1 μg/mL），处理时间（4小时、24小时）
        阅读提示：Materials and Methods- dsDNA stimulation
        流式细胞术
        抗体克隆号、稀释度、细胞数量、染色条件（3% FBS/PBS，15分钟冰上）
        阅读提示：Materials and Methods- Flow cytometry assay
        动物实验
        小鼠品系（NSG）、年龄（3周）、辐射剂量（2 Gy）、CD34+细胞数量（35,000）、植入方式（静脉、皮下）、细胞数量（5×10^6）、Matrigel浓度（30%），PEM剂量（100 mg/kg i.p.）
        阅读提示：Materials and Methods- Murine and tumor implantation studies
        T细胞功能检测
        J76 TCR-LMP2B细胞与肿瘤细胞共培养比例（E:T比），肽段浓度（0.1,1,10 μg/mL），培养时间（72小时）
        阅读提示：Results and Figure 2 legend

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