TCGA及单细胞转录组分析
探究不同驱动基因突变与CRC中分泌细胞分化状态的关系
分析TCGA COAD数据中BRAF、KRAS等突变与EEC祖细胞及成熟标志物表达的关系；对HT29和H508细胞系及正常结肠进行单细胞RNA-seq，鉴定细胞类型并比较差异。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LSD1和异常DNA甲基化介导肠内分泌祖细胞的持续存在，从而支持BRAF突变型结直肠癌
LSD1 and Aberrant DNA Methylation Mediate Persistence of Enteroendocrine Progenitors That Support BRAF-Mutant Colorectal Cancer
实验完整度
高包含TCGA及单细胞测序分析、体外细胞系及类器官实验、qMSP、ELISA、免疫荧光、Western blot、原位异种移植小鼠模型等多层级验证。
主要模型
HT29细胞系（BRAF V600E突变） NCI-H508细胞系（BRAF G596R突变） 患者来源类器官（817 BRAF突变，519 KRAS突变，83正常结肠） 结肠原位异种移植小鼠模型
重点核对
LSD1敲低对EEC祖细胞和杯状细胞比例的影响（HT29、H508细胞和817类器官） NEUROD1启动子CpG岛甲基化状态（HT29、H508、LS174T细胞和类器官） DAC和ISX-9处理对NEUROD1及分化标志物表达的影响 TFF3中和抗体对细胞存活和AKT磷酸化的影响 LSD1敲低对原位肿瘤体积和肺转移灶数量的影响
摘要
尽管分泌细胞（包括杯状细胞和肠内分泌细胞（EEC））与含有黏蛋白的不同结直肠癌（CRC）组织学亚型相关，但它们在CRC进展中的作用尚未得到充分研究。在此，我们对TCGA和单细胞RNA-seq数据的分析表明，EEC祖细胞在BRAF突变型CRC患者肿瘤、细胞系和患者来源的类器官中富集。在BRAF突变型CRC中，EEC祖细胞通过DNA甲基化和NEUROD1（中间EEC分化所需的关键基因）的沉默而受阻，无法进一步分化。机制上，分泌细胞及其分泌的因子（如三叶草因子3）促进了整个细胞群体的集落形成和细胞存活通路的激活。LSD1被确定为体外和结肠原位异种移植模型中分泌细胞特化的关键调节因子，在体内模型中，LSD1缺失可阻断EEC祖细胞的形成，并减少肿瘤生长和转移。这些发现揭示了EEC祖细胞在支持CRC中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 分泌细胞（特别是EEC祖细胞）是否以及如何促进BRAF突变型结直肠癌的进展？
- 核心机制
- 在BRAF突变型CRC中，NEUROD1启动子CpG岛高甲基化导致其表达沉默，从而阻断EEC分化，导致EEC祖细胞积累；LSD1是维持EEC祖细胞所必需的，其缺失导致分泌细胞减少，进而降低TFF3分泌，抑制AKT磷酸化，最终减少肿瘤生长和转移。
- 主要证据
- TCGA和单细胞RNA-seq分析显示BRAF突变肿瘤富集EEC祖细胞；体外细胞系和类器官中NEUROD1甲基化及DAC/ISX-9处理实验证实分化阻断；LSD1敲低导致分泌细胞丢失、TFF3减少、AKT活性降低，体内模型肿瘤生长和转移减少。
- 研究意义
- 该研究确立了EEC祖细胞作为BRAF突变型CRC的潜在驱动群体，并将LSD1确立为清除这些肿瘤中EEC祖细胞的新型治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DNA甲基化分析与药物处理验证
验证NEUROD1启动子甲基化是否阻断EEC分化
使用TCGA甲基化数据分析NEUROD1启动子甲基化与表达的相关性；qMSP检测细胞系和类器官中NEUROD1甲基化；用DAC（DNA甲基转移酶抑制剂）和ISX-9（促EEC分化剂）单独或联合处理，检测NEUROD1及分化标志物表达。
分泌细胞功能分析
探究EEC祖细胞及分泌细胞是否分泌促肿瘤因子并影响细胞存活
通过单细胞转录组分析分泌细胞表达谱，鉴定TFF3等分泌因子；使用shRNA敲低ATOH1或NEUROG3以去除分泌细胞，检测TFF3表达和分泌；用TFF3中和抗体处理细胞，评估细胞存活。
LSD1敲低及表型分析
验证LSD1是否调控分泌细胞特化并影响肿瘤进展
在HT29、H508细胞和817类器官中敲低LSD1，检测分泌细胞比例、EEC和杯状细胞标志物表达；进行单细胞RNA-seq和RNA velocity分析；进行条件培养基及TFF3中和抗体实验检测AKT磷酸化；进行原位异种移植小鼠模型评估肿瘤生长和转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoys 5A培养基 | Corning | -- |
| RPMI 1640培养基 | Corning | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10X Genomics | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq S2试剂盒v1.0（100循环） | Illumina | -- | |
| TFF3 ELISA | TFF3 ELISA试剂盒 | R&D systems | DTFF30 |
| 细胞增殖检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7572 |
| RNA提取 | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| RNeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| DNA提取 | DNeasy试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| QIAamp DNA微量试剂盒 | Qiagen | 56304 | |
| 甲基化分析 | EZ DNA甲基化闪电试剂盒 | Zymo Research | D5030 |
| 免疫荧光 | 抗LSD1抗体 | CST | #2139 |
| 抗TFF3抗体 | R&D systems | MAB4407 | |
| 抗SUSD2抗体 | Biolegend | #327406 | |
| 抗MUC2抗体 | Fisher | PA5-21329 | |
| 抗INSM1抗体 | Santa Cruz | #271408 | |
| 抗P物质抗体 | Abcam | ab10353 | |
| 山羊抗豚鼠IgG Alexa Fluor 488二抗 | Abcam | ab150185 | |
| Leica SP8激光扫描共聚焦系统 | Leica Microsystems | -- | |
| 免疫组织化学 | 小鼠HRP SignalStain增强试剂 | CST | #8125 |
| DAB底物 | -- | -- | |
| 蛋白质提取 | Qiashredder柱 | Qiagen | -- |
| 慢病毒感染构建 | pLenti-U6-tdTomato-P2A-BlasR (LRT2B)病毒 | Addgene | 1108545 |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| IVIS成像系统 | -- | -- | |
| 阿尔辛蓝溶液 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| 核固红溶液 | Electron Microscopy Sciences | 16323-02 | |
| 细胞处理 | 地西他滨 | -- | -- |
| ISX-9 | -- | -- | |
| TFF3中和抗体 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系培养基条件、血清浓度、培养环境 阅读提示：Methods: Cell, organoid culture and treatments |
| 基因敲低 | shRNA靶点序列、感染方式、筛选时间及浓度 阅读提示：Methods: Knockdown |
| DNA甲基化分析 | qMSP引物序列、M/U计算方法 阅读提示：Methods: Quantitative Methylation Specific PCR (qMSP) |
| 药物处理 | DAC和ISX-9的浓度、处理时间、联合处理顺序 阅读提示：Methods: Cell, organoid culture and treatments; Figure 3 legend |
| 细胞功能检测 | TFF3中和抗体浓度、EGF浓度、细胞活力检测平台 阅读提示：Methods: TFF3 ELISA, MTT assay, and CellTiter-Glo assay; Figure 5 legend |
| 体内实验 | 细胞接种数量、小鼠品系、实验终点、样本量（n=4） 阅读提示：Methods: Orthotopic xenograft mouse model; Figure 7 legend |