评估葡萄糖饥饿对H2Aub的影响
确定葡萄糖饥饿是否调节H2Aub水平及其是否依赖于能量应激和AMPK
将UMRC6、H460等多种癌细胞在无葡萄糖培养基中培养不同时间，或在不同葡萄糖浓度下培养，通过Western blot检测H2Aub水平；同时用AICAR、2DG、二甲双胍、苯乙双胍或A769662处理细胞，检测H2Aub和AMPK磷酸化；并生成AMPKα1/α2双敲除细胞，检测葡萄糖饥饿下H2Aub变化。
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H2A单泛素化将葡萄糖可用性与内质网应激反应的表观遗传调控及癌细胞死亡联系起来
H2A Monoubiquitination Links Glucose Availability to Epigenetic Regulation of the Endoplasmic Reticulum Stress Response and Cancer Cell Death
实验完整度
高包含细胞实验、转录组和表观基因组测序（RNA-seq、ChIP-seq）、基因敲除/敲低、药物处理及体内异种移植模型等多层级验证。
主要模型
UMRC6人肾透明细胞癌细胞系 H460人肺癌细胞系 H460异种移植瘤裸鼠模型
重点核对
葡萄糖饥饿时间（0-24小时）和浓度（0-25 mM）对H2Aub水平的影响 AMPKα1/2双敲除细胞中葡萄糖饥饿对H2Aub的抑制效应 BMI1敲低或PRT-4165抑制PRC1对H2Aub水平和ER应激基因表达的影响 NAC或2DG补充对葡萄糖饥饿诱导的ROS、BMI1磷酸化和H2Aub变化的逆转作用 BAY-876和PRT-4165联合处理对H460异种移植瘤生长的抑制
摘要
基因转录的表观遗传调控已被证明与营养可用性相协调，但其潜在机制仍不完全清楚。在此，我们表明葡萄糖饥饿抑制组蛋白H2A K119单泛素化（H2Aub），这是一种与基因抑制相关的组蛋白修饰。葡萄糖饥饿抑制H2Aub水平不依赖于能量应激介导的AMPK激活，可能通过NADPH耗竭并随后抑制BMI1，BMI1是催化染色质上H2Aub的多梳抑制复合物1（PRC1）的组成部分。整合的转录组学和表观基因组学分析将葡萄糖饥饿介导的H2Aub抑制与内质网（ER）应激反应相关基因的激活联系起来。我们进一步证明，这种表观遗传机制在葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡中发挥作用，并且药理学抑制葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和PRC1协同促进ER应激并在体内抑制肿瘤生长。总之，这些结果揭示了一种以前未被认识的表观遗传机制，将葡萄糖可用性与ER应激反应偶联起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 葡萄糖可用性如何通过表观遗传机制调控内质网应激反应及癌细胞死亡？
- 核心机制
- 葡萄糖饥饿通过NADPH耗竭促进BMI1磷酸化，抑制PRC1结合到ER应激基因启动子，降低H2Aub水平，从而解除对ER应激基因的抑制，促进ER应激反应和细胞死亡。
- 主要证据
- Western blot显示葡萄糖饥饿降低H2Aub并诱导BMI1磷酸化；ChIP-qPCR显示H2Aub和BMI1在ATF3/DDIT3启动子结合减少；RNA-seq和ChIP-seq整合分析显示ER应激基因激活；ATF4敲除和PRT-4165处理的功能实验证明协作作用；异种移植模型显示GLUT1和PRC1抑制剂联合抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了葡萄糖可用性与ER应激反应之间的新型表观遗传机制，并提示联合抑制GLUT1和PRC1可能是一种潜在的抗癌治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组分析H2Aub和基因表达
鉴定葡萄糖饥饿下H2Aub变化相关基因及生物学通路
UMRC6细胞在有或无葡萄糖条件下进行H2Aub ChIP-seq和RNA-seq，整合分析差异H2Aub结合和表达基因，进行GO和KEGG富集分析。
验证H2Aub对ER应激基因的调控
验证葡萄糖饥饿是否通过减少H2Aub结合激活ER应激基因表达
通过ChIP-qPCR检测H2Aub在ATF3和DDIT3启动子的结合，RT-PCR检测mRNA水平，Western blot检测ER应激标志物。
研究BMI1磷酸化及其与ER应激基因启动子的结合
探究葡萄糖饥饿是否通过BMI1磷酸化降低其结合和H2Aub水平
通过ChIP-qPCR检测BMI1在ATF3/DDIT3启动子的结合；通过Western blot和Phos-tag凝胶检测BMI1磷酸化；BMI1敲低后检测H2Aub和ER应激基因表达。
机制研究：NADPH耗竭作用
确定NADPH耗竭在葡萄糖饥饿诱导BMI1磷酸化和H2Aub减少中的作用
检测葡萄糖饥饿下ROS水平和NADPH水平；用ROS清除剂NAC、Tempol、Trolox或2DG处理细胞，检测ROS、NADPH、BMI1磷酸化和H2Aub水平。
功能验证：PRC1和ATF4在细胞死亡中的作用
确定PRC1失活和ATF4诱导在葡萄糖饥饿诱导细胞死亡和ER应激中的作用
用PRT-4165预处理细胞或BMI1敲低，再葡萄糖饥饿，检测细胞死亡和ATF3/DDIT3表达；生成ATF4敲除细胞，检测ER应激基因表达和细胞死亡。
体内验证：GLUT1和PRC1抑制剂联合效果
评估GLUT1和PRC1抑制剂联合是否促进ER应激并抑制肿瘤生长
检测BAY-876和PRT-4165单独或联合对UMRC6和H460细胞ATF3/DDIT3表达、细胞死亡和生长的影响；在H460异种移植模型中检测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | TR1003G | |
| 嘌呤霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 药物处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | D6134 |
| 苯乙双胍 | Sigma | P7045 | |
| 衣霉素 | Sigma | T7765 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A7250 | |
| A-769662 | LC laboratories | A-1803 | |
| 阿卡地新 | ThermoFisher Scientific | A611700 | |
| ISRIB | Apexbio | B3699 | |
| 布雷菲德菌素A | Cayman Chemical | #11861 | |
| 毒胡萝卜素 | Santa Cruz | sc-24017A | |
| PRT-4165 | Abcam | ab146003 | |
| BAY-876 | Sigma | SML1774 | |
| SP600125 | Selleckchem | S1460 | |
| SB203580 | Selleckchem | S1076 | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | Roche | -- |
| 细胞活性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | APExBIO | K1018 |
| ATP检测 | CellTiter-Glo发光检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| Western blot | H3K27me3抗体 | MilliporeSigma | 07-449 |
| 微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #2144 | |
| H2Aub抗体 | MilliporeSigma | 05-678 | |
| H2A抗体 | MilliporeSigma | ABE327 | |
| 纽蛋白抗体 | Sigma | V4505 | |
| AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | #5832 | |
| 磷酸化AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | #2535 | |
| AMPKα1抗体 | Cell Signaling Technology | #2795 | |
| AMPKα2抗体 | Cell Signaling Technology | #2757 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | #3398 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | #9722 | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | #11815 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | #4668 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | #9252 | |
| XBP1s抗体 | Cell Signaling Technology | #12782 | |
| ATF3抗体 | Cell Signaling Technology | #33593 | |
| DDIT3抗体 | Cell Signaling Technology | #2895 | |
| BMI1抗体 | Cell Signaling Technology | #6964 | |
| RING1A抗体 | Cell Signaling Technology | #13069 | |
| RING1B抗体 | Cell Signaling Technology | #5694 | |
| 蛋白质去磷酸化 | λ蛋白质磷酸酶 | New England Biolabs | P0753 |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | ThermoFisher Scientific | D399 |
| NADPH测量 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | Sigma | G4134 |
| 葡萄糖摄取 | 2-[1-14C] 2-脱氧葡萄糖 | 文中未明确说明 | -- |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| ChIP-seq | H2Aub抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 |
| H2Av抗体 | ActiveMotif | 61686 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| SuperScript II逆转录酶 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal | ThermoFisher Scientific | #11762100 | |
| 细胞培养 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | #52961 |
| 靶向BMI1的pGIPZ短发夹RNA | Functional Genomics Core at The University of Texas MD Anderson Cancer Center | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和葡萄糖饥饿 | 细胞系（UMRC6、H460等），培养基（DMEM或RPMI-1640+10%FBS），葡萄糖饥饿时间和浓度，透析FBS 阅读提示：Methods: Cell culture studies; Figure 1 legends |
| 药物处理 | 药物浓度和处理时间，包括PRT-4165（50μM）、BAY-876（2-5μM）、NAC（5mM）、2DG（10mM）等 阅读提示：Methods: Constructs and reagents; Figure legends for relevant figures |
| 基因操作 | CRISPR/Cas9敲除或shRNA敲低的目标基因，lentiviral包装系统，筛选抗生素 阅读提示：Methods: Cell culture studies; Constructs and reagents |
| 分子检测 | Western blot抗体和稀释比例，RT-qPCR引物，ChIP-qPCR抗体和引物 阅读提示：Methods: Western blotting, Real-time PCR, ChIP-qPCR; Table S1 |
| 体内实验 | 小鼠品系（athymic nude mice），周龄和性别，注射细胞数，给药途径和剂量 阅读提示：Methods: Xenograft model; Figure 7 legends |