体外集落形成实验验证克唑替尼对患者CD34+细胞增殖的抑制
验证克唑替尼能否抑制MPN患者造血祖细胞的增殖。
从MPN患者外周血分离CD34+细胞，在添加生长因子的甲基纤维素培养基中，用0.5μM或1μM克唑替尼处理，统计集落形成单位（CFU）和红系爆式集落形成单位（BFU-E）。
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克唑替尼在费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤中具有临床前疗效
Crizotinib Has Preclinical Efficacy in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms
实验完整度
高包含患者样本、JAK2突变细胞系、转基因及移植小鼠模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证（增殖、集落形成）和机制验证（相互作用、敲低/敲除）。
主要模型
JAK2V617F敲入小鼠模型（JAK2V617FloxP/+;Vav1-Cre） MPN患者外周血CD34+细胞 JAK2突变细胞系（HEL、SET2） JAK2-V617F逆转录病毒骨髓移植小鼠模型
重点核对
克唑替尼处理剂量：体内100mg/kg，口服，每周5天，共3周；体外0.5μM和1μM 细胞系：HEL（RRID:CVCL_0001）和SET2（RRID:CVCL_2187） 患者样本：MPN患者外周血CD34+细胞，来自Montefiore Hospital hematology biobank（IRB# 2013-2918） ruxolitinib耐药细胞：SET2和HEL ruxolitinib-persistent细胞 RON敲低：4种MST1R shRNA构建体（Origene，Cat# TL320425）
摘要
目的：费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤（MPNs）包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，其特征是JAK/STAT通路激活。JAK抑制剂已被批准用于MPN治疗，但由于JAK/STAT再激活，已观察到耐药持续存在。实验设计：使用MPN患者样本、JAK2突变的细胞系和MPN小鼠模型，我们检测了克唑替尼（被批准用于治疗非小细胞肺癌的ALK/MET/RON/ROS1抑制剂）改变MPN细胞增殖和JAK/STAT激活的疗效及机制。结果：我们发现克唑替尼抑制JAK2/STAT信号通路的活化和增殖，并降低JAK2V617F MPN小鼠模型的疾病负担。此外，我们发现克唑替尼能够克服对ruxolitinib的JAK抑制剂耐药。有趣的是，在ruxolitinib耐药细胞中，克唑替尼靶点RON激酶的磷酸化增强。我们显示磷酸化JAK2和磷酸化RON可以物理相互作用以维持JAK/STAT信号传导，并且克唑替尼和ruxolitinib的组合破坏了这种相互作用。此外，RON敲低抑制JAK2突变细胞中JAK/STAT信号的增殖和激活，并且在JAK2V617F MPN小鼠模型中删除了RON可降低疾病负担。我们还观察到MPN患者细胞中RON的过度激活，表明RON可能是克唑替尼在MPN中的重要靶点。结论：总之，我们证明了克唑替尼在MPN患者细胞、JAK2突变细胞系和JAK2突变小鼠模型中具有临床前疗效，并且克唑替尼与JAK抑制剂联合使用可抑制JAK抑制剂耐药。我们的工作表明应研究克唑替尼用于MPN患者的治疗。关键词：克唑替尼，JAK/STAT，MPN，耐药，骨髓增殖性
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 克唑替尼是否对费城染色体阴性MPN具有疗效，并能否克服JAK抑制剂耐药？
- 核心机制
- 磷酸化RON与磷酸化JAK2物理相互作用以维持JAK/STAT信号传导，导致JAK抑制剂耐药；克唑替尼抑制RON激酶，破坏该相互作用，从而抑制JAK/STAT信号。
- 主要证据
- 克唑替尼抑制MPN患者CD34+细胞集落形成和JAK/STAT磷酸化；在JAK2V617F小鼠模型中降低脾脏重量；在HEL和SET2细胞中抑制增殖和JAK2/STAT磷酸化；在耐药细胞中，联合ruxolitinib破坏pRON-pJAK2相互作用并恢复敏感性；RON敲低或敲除减弱JAK/STAT信号和疾病负担。
- 研究意义
- 作者建议应研究克唑替尼用于MPN患者的治疗，特别是单药或联合JAK抑制剂以克服耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内JAK2V617F敲入小鼠模型验证克唑替尼疗效
验证克唑替尼在体内能否降低MPN疾病负担。
对JAK2V617FloxP/+;Vav1-Cre小鼠（6周龄）以100mg/kg克唑替尼口服灌胃，每周5天，共3周，检测脾脏重量、血细胞计数和组织学。
体外细胞增殖和信号通路检测
验证克唑替尼对JAK2突变细胞系的直接抑制作用及对JAK/STAT信号的影响。
用不同浓度克唑替尼处理HEL和SET2细胞，测定细胞活力（CellTiter-Glo）；用Western blot检测JAK2、STAT3、STAT5磷酸化。
ruxolitinib耐药细胞的生成和组合处理
验证克唑替尼能否克服JAK抑制剂耐药。
使用SET2和HEL ruxolitinib-persistent细胞，单独或联合使用克唑替尼和ruxolitinib，检测细胞活力、STAT5/3磷酸化，并进行协同分析（ZIP）。
RON和JAK2相互作用的验证
验证磷酸化RON与磷酸化JAK2物理相互作用，以及克唑替尼能否破坏该相互作用。
在SET2-persistent细胞中进行免疫共沉淀（co-IP）检测pRON和pJAK2的结合，并用克唑替尼和ruxolitinib联合处理观察相互作用是否被破坏。
RON shRNA敲低验证其功能
验证RON在JAK2突变细胞中调控JAK/STAT信号和增殖。
用靶向MST1R的shRNA慢病毒转导HEL和SET2细胞，通过qPCR确认敲低效率，检测细胞集落形成和JAK2/STAT3/5磷酸化。
RON敲除小鼠移植实验验证体内效果
验证RON缺失在体内是否抑制JAK2V617F诱导的MPN。
利用Stk−/−小鼠和野生型小鼠的骨髓cKit+细胞感染JAK2V617F-GFP逆转录病毒，移植到致死照射的受体小鼠，监测外周血WBC、Hb和GFP%随时间变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CD34+细胞分离 | Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| 人CD34磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | |
| 集落形成实验 | 人StemMACS完全培养基 | Miltenyi Biotec | 130-091-280 |
| M3434甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| M3334甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CV |
| DMEM培养基 | Corning | 15-017-CV | |
| 胎牛血清 | Gemini | 900-108 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 细胞刺激 | 重组人促红细胞生成素 | Cell Sciences | CRE600B |
| 重组人干细胞因子 | Peprotech | 300-07 | |
| 重组人肝细胞生长因子 | Peprotech | 10039H | |
| 药物处理 | 克唑替尼 | Selleckchem (体外) | S1068 |
| 鲁索替尼 | Selleckchem | S1378 | |
| 色瑞替尼 | Selleckchem | s7083 | |
| 阿来替尼 | Selleckchem | s2762 | |
| 蛋白检测 | 抗磷酸化JAK2抗体 | Cell Signaling Technology | 3771 |
| 抗JAK2抗体 | Cell Signaling Technology | 3230 | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640 | |
| 抗磷酸化STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9314 | |
| 抗STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 94205 | |
| 抗RON抗体 | Cell Signaling Technology | 2654 | |
| 抗磷酸化RON抗体 | R&D Systems | AF1947 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| Western blot | NuPAGE 7% Tris-醋酸蛋白凝胶 | Thermo Fisher | EA0358BOX |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒 | Promega | G9241 |
| shRNA转导 | MST1R shRNA质粒试剂盒 | Origene | TL320425 |
| MET shRNA质粒试剂盒 | Origene | TL320418 | |
| 乱序shRNA对照质粒 | Origene | TR30021 | |
| 分子克隆 | Qiagen HiSpeed质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12663 |
| 病毒包装 | Trans293转染试剂 | Origene | TT500002P5 |
| pCMVR8.74包装质粒 | Addgene | RRID:Addgene_22036 | |
| pCMV-VSVg质粒 | Addgene | RRID:Addgene_8453 | |
| 逆转录病毒包装 | MSCV-JAK2V617F-GFP质粒 | Gilliland lab | -- |
| 小鼠骨髓移植 | CD117磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-224 |
| 重组小鼠IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| 重组小鼠SCF | Peprotech | 250-03 | |
| 重组小鼠IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| 拜耳百病消100 | Bayer | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD71抗体 | BD Biosciences | BD-561937 |
| 抗小鼠Ter119抗体 | Thermo Fisher | 17-5921-82 | |
| 动物模型 | JAK2V617FloxP/+小鼠 | The Jackson Laboratory | Stock |
| Stk−/−小鼠 | -- | -- | |
| Western blot裂解液 | NP-40裂解液 | Alfa Aesar | J60902 |
| Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂片 | Thermo Scientific | A32961 | |
| Western blot封闭 | 含BSA的TBS-T | -- | -- |
| 免疫共沉淀 | Protein A磁珠 | Thermo Fisher | 22810 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内克唑替尼治疗 | 小鼠模型：JAK2V617FloxP/+;Vav1-Cre小鼠；给药方案：100mg/kg，口服，每周5天，持续3周；对照组：HCl酸化水；开始治疗时年龄：6周龄 阅读提示：材料与方法：In-vivo crizotinib treatment |
| 患者CD34+细胞集落形成实验 | 患者样本来源：MPN患者外周血CD34+细胞；细胞数量：4000个/孔；处理浓度：0.5μM和1μM；培养基：人StemMACS（含EPO）；培养时间：10-12天 阅读提示：材料与方法：Methylcellulose Colony Forming Unit Assays |
| 体外细胞活力测定 | 细胞系：HEL和SET2；细胞浓度：2x10^5 cells/mL；克唑替尼浓度：50nM, 100nM, 250nM, 500nM, 1μM, 2.5μM；检测试剂：CellTiter-Glo；孵育时间：未明确说明 阅读提示：材料与方法：Proliferation Assays |
| ruxolitinib耐药细胞组合治疗 | 细胞系：SET2-和HEL-ruxolitinib-persistent；药物：克唑替尼和ruxolitinib联合；ZIP协同分析参数；培养时间：3天 阅读提示：结果：Crizotinib promotes a sustained response to JAK inhibitor treatment；材料与方法：Proliferation Assays |
| RON shRNA敲低 | 细胞系：HEL和SET2；shRNA构建体：MST1R shRNA质粒（Origene Cat# TL320425）；转导试剂：polybrene（8μg/mL）；筛选浓度：嘌呤霉素2μg/mL；敲低验证：qPCR 阅读提示：材料与方法：Lentiviral Transduction；结果：RON kinase is an important target of crizotinib in MPN |