构建PSC和结肠炎小鼠模型
模拟胆管癌风险因素，研究肠道微生物对肝脏免疫的影响
使用BDL手术或Mdr2−/−小鼠建立PSC样模型，使用DSS或TNBS诱导结肠炎模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肠道微生物指导肝细胞招募MDSCs并促进胆管癌
Gut Microbiome Directs Hepatocytes to Recruit MDSCs and Promote Cholangiocarcinoma
实验完整度
高包含小鼠模型（BDL、Mdr2−/−、DSS结肠炎）、细胞系（HepG2、Hep3B）、患者样本及多组学分析，并进行了功能验证（MDSC抑制T细胞增殖）和机制验证（TLR4敲除等）。
主要模型
C57BL/6小鼠BDL诱导的PSC样模型 Mdr2−/−小鼠自发性PSC样模型 DSS诱导的结肠炎小鼠模型 肝细胞系HepG2和Hep3B
重点核对
新霉素处理清除革兰氏阴性菌后，肝内PMN-MDSC积累和肿瘤生长受抑 Tlr4−/−小鼠中LPS或DSS诱导的肝内PMN-MDSC积累消失 肝细胞特异性Tlr4敲除（Tlr4LKO）小鼠中DSS诱导的PMN-MDSC积累和肿瘤生长受抑 CXCL1中和抗体或CXCR2抑制剂SB225002处理后，肝内PMN-MDSC减少并抑制肿瘤生长 粪便移植实验：万古霉素处理的小鼠粪便（富含革兰氏阴性菌）移植到无菌小鼠后肝内PMN-MDSC增加
摘要
肠道菌群失调常见于肝硬化患者和慢性胃肠疾病患者，但其对肝脏抗肿瘤免疫的影响在很大程度上是未知的。在这里，我们研究了肠道微生物如何影响胆管癌的抗肿瘤免疫。原发性硬化性胆管炎（PSC）或结肠炎是胆管癌的两个已知风险因素，在小鼠中促进肿瘤发展，并导致CXCR2+多形核髓源性抑制细胞（PMN-MDSC）的积累。在患有PSC和结肠炎的小鼠中观察到的肠道屏障功能下降使得肠道来源的细菌和脂多糖（LPS）出现在肝脏中，并通过TLR4依赖性机制诱导肝细胞表达CXCL1，以及CXCR2+ PMN-MDSC的积累。相反，新霉素治疗阻断了CXCL1的表达、PMN-MDSC的积累，即使在缺乏肝病或结肠炎的情况下也抑制了肿瘤生长。我们的研究表明，肠道微生物通过增加PMN-MDSC来控制肝细胞形成免疫抑制环境，从而促进肝癌。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物如何影响肝脏抗肿瘤免疫，特别是对胆管癌进展的作用？
- 核心机制
- 肠道屏障功能障碍导致革兰氏阴性菌和LPS进入肝脏，通过肝细胞上的TLR4诱导CXCL1表达，进而通过CXCL1/CXCR2轴招募CXCR2+ PMN-MDSC，形成免疫抑制微环境，促进胆管癌生长。
- 主要证据
- 小鼠模型（BDL、Mdr2−/−、DSS结肠炎）中观察到肝内PMN-MDSC积累和肿瘤生长加速；LPS处理或粪便移植可诱导PMN-MDSC积累；Tlr4缺失或肝细胞特异性Tlr4敲除抑制PMN-MDSC积累和肿瘤生长；CXCL1过表达或中和抗体、CXCR2抑制剂实验证实CXCL1/CXCR2轴的关键作用。
- 研究意义
- 该研究揭示了肠道微生物通过肝细胞形成免疫抑制微环境促进胆管癌的机制，并提示靶向革兰氏阴性菌或TLR4/CXCL1/CXCR2通路可能作为胆管癌的预防和治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测肠道屏障功能和细菌移位
验证PSC和结肠炎导致肠道通透性增加和细菌移位到肝脏
通过FITC-dextran实验检测肠道通透性，通过16s rRNA定量和细菌培养检测门静脉血和肝脏中的细菌，通过FISH可视化细菌。
分析肝内MDSC积累
确定PSC和结肠炎是否导致肝内MDSC积累以及其免疫抑制功能
通过流式细胞术分析肝内免疫细胞亚群，特别是CD11b+Gr1+细胞；通过抑制T细胞增殖实验验证MDSC的免疫抑制功能。
验证肠道细菌的作用
确定革兰氏阴性菌是否通过LPS/TLR4通路驱动MDSC积累
使用新霉素（抗革兰氏阴性菌）和万古霉素（抗革兰氏阳性菌）处理小鼠，进行粪便移植实验；检测门静脉血LPS浓度；使用LPS腹腔注射和Tlr4−/−小鼠。
识别CXCL1/CXCR2轴的作用
确定CXCL1和CXCR2在MDSC积累中的必要性
检测肝内CXCL1表达，通过肝细胞特异性过表达CXCL1、使用中和抗体或CXCR2抑制剂（SB225002）来验证。
确定肝细胞TLR4的关键作用
验证肝细胞上的TLR4是否介导LPS诱导的CXCL1表达和MDSC积累
使用肝细胞特异性Tlr4敲除小鼠（Tlr4LKO）和骨髓嵌合体小鼠进行DSS处理。
评估PSC和结肠炎对胆管癌生长的影响
检测PSC和结肠炎是否促进胆管癌的生长
使用水动力注射AKT+YAP或AKT+NICD1诱导胆管癌，并在BDL、Mdr2−/−或DSS小鼠中进行。
验证MDSC在胆管癌中的作用
确定MDSC是否通过CXCL1/CXCR2轴促进胆管癌生长
使用抗Ly6G抗体消耗PMN-MDSC，或使用CXCL1中和抗体、SB225002，观察肿瘤生长变化。
评估NK细胞的作用
确定MDSC是否通过抑制NK细胞功能促进肿瘤生长
使用抗NK抗体消耗NK细胞，观察肿瘤生长变化。
患者样本和临床数据验证
将动物模型发现推广到人类患者
检测肝硬化患者肝组织中的LPS，评估TLR4基因签名与患者生存的相关性，以及人类肝细胞系中LPS诱导的CXCL1/IL-8表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | -- | -- |
| 脂多糖 | Sigma | L2880 | |
| 抗Ly6G抗体（克隆1A8） | BioxCell | -- | |
| CXCL1中和抗体（MAB453） | R&D Systems | -- | |
| SB225002 | Tocris Bioscience | -- | |
| FITC-葡聚糖（4KDa） | Sigma | -- | |
| 肠道通透性检测 | ToxinSensor™显色LAL内毒素检测试剂盒 | GenScript | L00250 |
| 细菌检测 | EUB338探针 | -- | -- |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | Sigma | C5138 |
| Optiprep | -- | -- | |
| 分子检测 | RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| iScript™ cDNA合成试剂盒 | BIO-RAD | 170-8891 | |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 | |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 | |
| iQ SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1708882 | |
| 蛋白质检测 | 哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | BioRad | -- | |
| 抗CK-7抗体（ab181598） | Abcam | -- | |
| 抗CK-19抗体（ab52625） | Abcam | -- | |
| 抗β-Actin抗体（4970S） | Cell Signaling Technology | -- | |
| Clarith/Clarity Max ECL | BioRad | -- | |
| 免疫组化 | 通用动物免疫组化试剂盒 | Innovex | KT4418A |
| 抗HNF-4α抗体（sc-374229） | Santa Cruz | -- | |
| 抗MPO抗体（PP023AA） | Biocare Medical | -- | |
| 抗CD15抗体（M3631） | DAKO | -- | |
| 抗脂多糖核心单抗WN1 222-5（HM6011） | HycultBiotech | -- | |
| ELISA | 人GROα ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS2122 |
| 人IL-8 ELISA试剂盒 | Invitrogen | KHC0081 | |
| 细胞分离 | 髓源性抑制细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-094-538 |
| 细胞培养 | T细胞激活/扩增试剂盒 | Miltenyi | 130-093-627 |
| 细胞染色 | Foxp3/转录因子染色缓冲液 | eBioscience | -- |
| 流式细胞术 | FACS Aria II | BD Biosciences | -- |
| 测序分析 | Illumina MiSeq平台 | Illumina | -- |
| 细菌鉴定 | MALDI-TOF质谱（BioTyper） | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | BDL手术的具体步骤、Mdr2−/−小鼠的周龄和性别、DSS的浓度和周期 阅读提示：Methods: Animal studies |
| 肠道通透性和细菌移位检测 | FITC-dextran的剂量和观测时间、门静脉血采集方法、细菌培养条件 阅读提示：Methods: Gut permeability assay, Bacteria translocation |
| MDSC分析 | 流式抗体组合和门控策略、MDSC的绝对计数方法 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| LPS/TLR4通路验证 | LPS的注射剂量和途径、Tlr4−/−小鼠来源、CXCL1中和抗体的剂量和方案、SB225002的剂量和方案 阅读提示：Methods: Animal studies, Figure legends |
| 肿瘤模型 | 水动力注射的质粒比例和体积、肿瘤细胞系LD1和RIL175的注射数量和途径 阅读提示：Methods: Animal studies, Cell lines |
| 患者样本分析 | 患者队列的纳入标准、组织样本处理、TLR4基因签名定义和分组阈值 阅读提示：Methods: Human cohort, Survival analysis |