FTD/ALS患者脑样本APA分析
评估TDP-43核丢失是否与患者脑中的APA变化相关
使用已有RNA-seq数据集（GSE126542），对TDP-43阳性和阴性神经元核进行APA分析（APAlyzer和QAPA）。
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FTD/ALS中TDP-43核丢失导致广泛的选择性多聚腺苷酸化变化
TDP-43 nuclear loss in FTD/ALS causes widespread alternative polyadenylation changes
实验完整度
高包含患者脑样本RNA-seq分析、干细胞来源神经元TDP-43敲低、3' end-seq高分辨率作图、功能验证（蛋白水平、NMD、荧光素酶报告）及患者脑样本验证。
主要模型
人胚胎干细胞（H1）来源的iNeurons（NGN2过表达诱导） HEK293T细胞（荧光素酶报告实验） FTD/ALS患者死后脑组织样本（神经元核分选RNA-seq） FTLD-TDP患者额叶皮层尸检样本（qRT-PCR验证）
重点核对
TDP-43敲低效率（7天或12天，通过Western blot验证） iNeurons分化方案（NGN2过表达，培养时间） 3' end-seq建库试剂盒（Quantseq REV kit, Lexogen） FTLD-TDP患者样本分组（对照n=53，FTD n=221） qRT-PCR检测SFPQ和TMEM106B 3' UTR长度的引物和条件
摘要
在额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化中，RNA结合蛋白TDP-43从大脑和脊髓神经元的细胞核中耗竭。TDP-43的一个关键功能已显现为在前体mRNA剪接过程中抑制隐性外显子的包含，但TDP-43在其他RNA加工事件中的作用仍未明确。这里我们显示，人类大脑神经元核中TDP-43的丢失以及TDP-43的致病性突变与广泛的选择性多聚腺苷酸化（APA）变化相关。利用高分辨率多聚腺苷酸化位点作图，我们全面定义了人类干细胞来源神经元中TDP-43调控的APA事件，并发现TDP-43结合的强度和位置影响polyA位点的使用。TDP-43丢失引起的APA事件影响疾病相关基因（例如SFPQ、NEFL和TMEM106B）的表达。这些发现提供了证据，表明除了隐性外显子包含外，APA变化是TDP-43病理的一个新方面。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TDP-43功能障碍是否通过影响选择性多聚腺苷酸化（APA）导致FTD/ALS病理？
- 核心机制
- TDP-43通过结合polyA位点下游的GU富集序列抑制polyA位点使用；TDP-43丢失时，弱结合位点首先释放，导致polyA位点使用改变。
- 主要证据
- 3' end-seq显示TDP-43敲低导致3206个基因APA变化；SFPQ和TMEM106B的3' UTR延长影响蛋白表达，并在FTLD-TDP患者脑样本中验证。
- 研究意义
- APA变化是TDP-43病理的新方面，可能作为治疗靶点，未来可探索反义寡核苷酸校正特定APA事件。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
iNeurons中TDP-43敲低验证APA变化
验证TDP-43敲低是否导致iNeurons中的APA变化
在人干细胞来源的iNeurons中敲低TDP-43（shRNA），进行RNA-seq和APA分析。
3' end-seq高分辨率APA作图
以单核苷酸分辨率全面绘制TDP-43依赖的APA事件
对TDP-43敲低和对照iNeurons进行3' end-seq，识别polyA位点，包括新位点和隐性位点。
验证TDP-43结合特征对APA的影响
确定TDP-43结合的位置和强度如何影响polyA位点使用
将TDP-43调控的APA位点与CLIP-seq数据交叉，分析TDP-43结合距离、GU含量、polyA位点强度（Aparent2）与APA变化的关系。
评估APA变化对疾病相关基因表达的影响
确定TDP-43敲低是否改变疾病相关基因的表达
通过qRT-PCR、Western blot、NMD抑制、RNA稳定性实验、荧光素酶报告和患者脑样本验证，检测ELP1、NEFL、SFPQ和TMEM106B的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（1x）+ GlutaMax-I培养基 | Gibco | 10564011 |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| mTeSR1 Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| ReLeSR | STEMCELL Technologies | 100-0483 | |
| 细胞分化 | 神经元基础培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103049 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78429 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78426 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Invitrogen | 23225 |
| Western blot | LDS上样缓冲液 | Invitrogen | NP0008 |
| 4-12% Bis-Tris小型预制胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | 1704150 | |
| 小型Trans-Blot电泳槽 | Bio-Rad | 170-3930 | |
| EveryBlot封闭液 | Bio-Rad | 12010020 | |
| 抗TMEM106B抗体 | Cell Signaling Technology | 93334 | |
| 抗TDP-43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 抗ELP1抗体 | Cell Signaling Technology | 5071S | |
| 抗ELP3抗体 | Proteintech | 17016-1-AP | |
| 抗NEFL抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-14981 | |
| 抗SFPQ抗体（EPR11847） | Abcam | ab177149 | |
| 抗GAPDH抗体 | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| 抗GAPDH（D16H11）XP抗体 | Cell Signaling Technology | 8884S | |
| HRP标记的抗小鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | 62-6520 | |
| HRP标记的抗兔IgG（H+L） | Life Technologies | 31462 | |
| Amersham ECL Prime化学发光试剂盒 | Cytiva | RPN2232 | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | 34094 | |
| ChemiDox XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| 抗VAT1L抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-98934 | |
| 抗NeuN抗体 | EMD Millipore | MAB377 | |
| 抗Tuj1抗体 | Covance | MMS-435P | |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| Leica DMI6000 B显微镜 | Leica | -- | |
| HAMAMATSU ORCA-flash 4.0相机 | Hamamatsu | -- | |
| TMEM106B免疫印迹 | 4x Laemmli缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| 4-20% Tris-甘氨酸小型预制胶 | Thermo Fisher Scientific | XP04205BOX | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Zymo RNA清洁浓缩柱 | Zymo Research | -- | |
| RNA质量控制 | 高灵敏度RNA ScreenTape | Agilent Technologies | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio3实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 竞争PCR | GoTaq DNA聚合酶 | Promega | M3001 |
| RNA-seq | SMARTer链特异性总RNA-seq试剂盒v2 - Pico输入哺乳动物 | Takara | 634411 |
| 测序 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| 3' end-seq | Quantseq REV试剂盒 | Lexogen | -- |
| D1000高灵敏度芯片 | Agilent Technologies | -- | |
| 测序 | NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
| NMD抑制 | 11j（SMG-1抑制剂） | MedChem Express | HY-124719 |
| 抗UPF1抗体 | Abcam | ab109363 | |
| 抗磷酸化UPF1抗体 | EMD Millipore | 07-1016 | |
| RNA提取 | Qubit荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 患者样本RNA提取 | RNAeasy Plus微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| 患者样本RNA质量检测 | Nanodrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 患者样本qRT-PCR | High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| SYBR GreenER qPCR预混液 | Invitrogen | -- | |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | pmirGLO双荧光素酶载体 | Promega | E1330 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2920 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | hESC H1细胞系来源、NGN2过表达诱导分化方案、培养时间（7天分化） 阅读提示：Methods: Stem cell maintenance and differentiation into iNeurons |
| TDP-43敲低 | shRNA序列（scrambled或TDP-43）、转导时间（7或12天）、敲低效率验证 阅读提示：Methods: TDP-43 KD in iNeurons; Fig. 1c |
| 3' end-seq | 建库试剂盒（Quantseq REV kit）、RNA起始量（500 ng）、样本数（3对照，3 KD）、测序平台（NextSeq 500/2000） 阅读提示：Methods: 3' end-seq |
| 患者样本验证 | 样本来源（Mayo Clinic Florida Brain Bank）、分组（对照n=53，FTD n=221）、RNA提取方法、qRT-PCR引物和条件 阅读提示：Methods: Evaluation of SFPQ 3' UTR length, SPFQ cryptic splicing and TMEM106B 3' UTR length in FTLD-TDP brain samples by qRT-PCR |
| NMD抑制和RNA稳定性 | 11j浓度、处理时间、放线菌素D浓度（20 µM）及时间点（0,1,3,6小时） 阅读提示：Methods: Inhibition of the NMD; Pulse-chase experiment using actinomycin-D |