建立碱烧伤模型并敲低角膜缘Prox1
验证AAV-shProx1能否有效敲低角膜缘Prox1表达，并构建角膜损伤模型以研究其对修复的影响。
雄性C57BL/6小鼠，通过结膜下注射AAV-shProx1或AAV-sham敲低Prox1，4周后使用0.5 M NaOH滤纸片建立中央角膜碱烧伤模型。分别在损伤后不同时间点取材。
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角膜缘淋巴管中的Prox1蛋白维持角膜缘干细胞干性并调节角膜损伤修复
Prox1 Protein in Corneal Limbal Lymphatic Vessels Maintains Limbal Stem Cell Stemness and Regulates Corneal Injury Repair
实验完整度
高包含体内碱烧伤模型（AAV敲低Prox1）、体外共培养模型（LECs与TKE2）、转录组测序及蛋白/RNA验证，形成多层次功能验证。
主要模型
C57BL/6小鼠碱烧伤模型 TKE2小鼠角膜缘上皮祖细胞系 人淋巴内皮细胞（LECs）
重点核对
AAV-shProx1序列及敲低效率 碱烧伤模型诱导参数（0.5 M NaOH，30秒） 共培养系统中siProx1转染浓度（100 nM） 关键分子表达验证（Ki67、ΔNp63、K14、Prox1、Lyve1） 炎症因子检测（IL-1β、TNF-α）
摘要
目的：本研究旨在阐明角膜淋巴管Prox1基因在调节角膜缘干细胞干性和促进角膜损伤修复中的作用。方法：通过腺相关病毒（AAV）敲低角膜缘Prox1基因。在正常组、AAV-sham组和AAV-shProx1组中诱导碱烧伤模型。在损伤后第1、3、7、14和21天立即进行眼前段摄影、荧光素钠染色和苏木精-伊红（H&E）染色。使用免疫荧光染色评估Ki67、ΔNp63和K14。此外，利用seq-mRNA技术对AAV-sham和AAV-shProx1组在损伤后7天进行比较转录组分析。通过蛋白质水平验证关键调控基因。进一步，采用淋巴内皮细胞（LECs）和角膜缘干细胞（LSCs）的共培养模型来研究LSCs的增殖能力和干性表达。结果：荧光素钠染色显示，损伤后第1天和第3天，AAV-shProx1组的上皮缺损面积显著大于AAV-sham组（P < 0.05）。在不同时间点，AAV-shProx1组的Ki67、ΔNp63和K14表达均低于AAV-sham组。此外，seq-mRNA结果表明，与AAV-sham组相比，AAV-shProx1组中基因（Prox1和Lyve1）下调，而炎症因子（Ccl2、Ccl7、IL16、IL1R和TNFsf11）上调。当LECs中Prox1被沉默时，LSCs的增殖和干性显著下调。结论：淋巴管中的Prox1和Lyve1蛋白是角膜损伤修复中的关键调控蛋白。角膜损伤期间淋巴管的引流作用不可或缺。关键词：角膜缘干细胞（LSCs），淋巴管，prox1，角膜上皮
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 角膜缘淋巴管中的Prox1基因是否通过调节淋巴管功能来维持角膜缘干细胞（LSCs）的干性和促进角膜损伤修复？
- 核心机制
- Prox1敲低导致淋巴管生成减少，Lyve1表达下调，淋巴引流功能降低，引起炎症因子（如IL-1β、TNF-α）和免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）在角膜缘积聚，从而损害LSC的增殖和干性，延迟角膜上皮修复。
- 主要证据
- 在碱烧伤小鼠模型中，AAV-shProx1组相比AAV-sham组上皮缺损面积更大，Ki67、ΔNp63和K14表达降低；体外共培养实验中，LECs敲低Prox1后LSC增殖和干性下降；转录组测序显示炎症通路相关基因上调。
- 研究意义
- 阐明淋巴管在角膜缘微环境中的重要作用，为促进LSC再生和角膜损伤修复提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估角膜上皮损伤和修复
比较Prox1敲低与对照组在碱烧伤后角膜上皮愈合速度和角膜透明度。
通过眼前段摄影、荧光素钠染色评估上皮缺损面积，H&E染色观察角膜缘上皮厚度，裂隙灯显微镜评分透明度，在损伤后第1、3、7、14、21天进行。
检测角膜缘干细胞增殖和干性标志物
评估Prox1敲低对LSC增殖和干性维持的影响。
通过角膜全铺片和冰冻切片的免疫荧光染色检测Ki67、ΔNp63和K14的表达，并进行定量分析。
转录组分析和差异基因验证
揭示Prox1敲低后角膜组织的转录组变化，特别是涉及炎症和免疫调节的基因。
损伤后7天取角膜，提取RNA进行seq-mRNA测序，使用DESeq2分析差异表达基因，进行GO和KEGG富集分析，并通过Western blot和RT-qPCR验证关键炎症因子（IL-1β、TNF-α）和淋巴管标记物（Lyve1、Prox1）的表达。
体外共培养验证LECs对LSC的功能影响
明确LECs及其Prox1表达对LSC增殖和干性的直接影响。
将TKE2（小鼠角膜缘上皮祖细胞）与人LECs共培养，或使用LEC条件培养基，通过EdU、Ki67染色评估增殖，Western blot和RT-qPCR检测干性标志物（K14、ΔNp63）的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物麻醉 | 丙美卡因滴眼液 | -- | -- |
| 术后处理 | 加替沙星眼用凝胶 | -- | -- |
| 病毒构建 | 腺相关病毒-shProx1 | Hanheng Biotechnology | -- |
| 腺相关病毒-对照 | Hanheng Biotechnology | -- | |
| 病毒注射 | Hamilton微量注射器 | Hamilton | -- |
| 细胞培养 | 无血清角质形成细胞培养基 | Gibco | -- |
| 人角质形成细胞生长添加物 | Gibco | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 原代内皮细胞培养体系 | icell | -- | |
| 细胞增殖检测 | Beyotime Edu试剂盒 | Beyotime | C0075L |
| siRNA转染 | Opti-MEM培养基 | -- | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA测序 | SMART-Seq HT试剂盒 | -- | -- |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Qubit 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq Xten测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | -- |
| Western blot | SDS上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 氯仿 | -- | -- | |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 75%乙醇 | -- | -- | |
| DEPC水 | -- | -- | |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Bio-Rad | -- |
| ABI Prism 7000荧光定量PCR仪 | -- | -- | |
| 抗体（免疫荧光、Western blot） | 抗Prox1抗体 | Abcam | Ab199359 |
| 抗Lyve1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0443-82 | |
| 抗K12抗体 | Abcam | Ab185627 | |
| 抗ΔNp63抗体 | Proteintech | 12143-1-AP | |
| 抗K14抗体 | Proteintech | 10143-1-AP | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | Ab16667 | |
| 抗体（Western blot） | 抗IL-1β抗体 | Abcam | Ab283818 |
| 抗TNF-α抗体 | Abcam | Ab183218 | |
| 抗Ccl2抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-17040 | |
| 抗体（免疫荧光） | 抗CD68抗体 | Abcam | Ab303565 |
| 抗CD11c抗体 | Cell Signaling Technology | 97585 | |
| 抗体（Western blot） | 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-lg |
| 显微成像 | 裂隙灯显微镜 | Optoprobe | -- |
| 全景显微镜 | Olympus | -- | |
| FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 高内涵显微镜系统 | PerkinElmer | -- | |
| 转盘共聚焦显微镜 | Andor | -- | |
| 细胞成像 | 光学显微镜 | Nikon | -- |
| 超声破碎 | 超声处理器 | Sonics | -- |
| 图像分析 | Image J软件 | NIH | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism统计软件 | Dotmatics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别，AAV注射剂量和位点，碱烧伤参数（NaOH浓度、时间、滤纸直径） 阅读提示：Methods：Establishment of the Alkali Burn Model；Subconjunctival Injection of Adeno-Associated Virus |
| 角膜损伤评估 | 角膜上皮缺损面积计算方法，角膜混浊评分标准，观察时间点 阅读提示：Methods：Anterior Segment Photography and Fluorescein Sodium Staining；Figure 3 legend |
| 体外共培养实验 | 细胞系来源（TKE2和LECs），培养基成分，共培养体系（Transwell），时间点（6、12、24小时） 阅读提示：Methods：Cell Lines；Figure 4 legend |
| siRNA敲低实验 | siRNA序列，转染浓度（100 nM），敲低效率验证方法（RT-qPCR和Western blot） 阅读提示：Methods：SiRNA Transfection；Table 1 |
| 蛋白和基因表达分析 | 抗体来源和货号，蛋白提取和定量方法，RT-qPCR引物序列 阅读提示：Methods：Western Blot；Quantitative Real-Time PCR；Table 2和Table 3 |
| 转录组测序分析 | RNA提取方法，文库构建试剂盒，测序平台，差异基因筛选阈值，富集分析方法 阅读提示：Methods：RNA Sequencing |