构建RHO过表达细胞模型
建立RHO及其突变体过表达的661w细胞模型，用于研究其对细胞能量代谢的影响。
将人RHO cDNA及其突变体（P23H、R135L、G188R）克隆到pcDNA3.1载体中，使用FuGENE HD转染试剂转染661w细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
视紫红质或其突变体的过表达导致661w细胞能量代谢功能障碍
Overexpression of Rhodopsin or Its Mutants Leads to Energy Metabolism Dysfunction in 661w Cells
实验完整度
高包含体外细胞模型（661w细胞）过表达实验，并通过OCR/ECAR、线粒体功能、代谢重编程、钙信号及截短突变等多维度验证，涵盖功能与机制验证。
主要模型
661w小鼠光感受器细胞系 RHO过表达细胞模型 c-tail截短突变模型
重点核对
细胞系：661w细胞 转染：FuGENE HD Transfection Reagent 处理：NAC (1 mM), Ru265 (10 µM), Compound C (1 µM), 2-APB (10 µM) 检测时间点：转染后24, 36, 48, 60小时 代谢分析：Seahorse XFe24分析仪，OCR和ECAR
摘要
目的：视网膜色素变性（RP）是一组以光感受器细胞变性为特征的异质性遗传疾病。视紫红质基因（RHO）是常染色体显性遗传RP（ADRP）最常见的病因，但RHO突变如何导致异质性表型仍不清楚。能量衰竭是RP进展过程中继发性视锥细胞死亡的主要原因，但其在ADRP RHO突变体诱导的原发性视杆细胞死亡中的作用尚不清楚。方法：选择了来自不同临床类别的三种RHO错义突变。在661w细胞（小鼠光感受器细胞系）中过表达野生型（WT）RHO及其突变体P23H（B1类）、R135L（A类）和G188R（B2类），并分别比较它们对氧化磷酸化（OXPHOS）和有氧糖酵解的影响。结果：本文报道，能量衰竭是由WT RHO及其突变体过表达引起的细胞死亡的早期事件。RHO过表达导致OXPHOS缺陷，这可能是线粒体丢失的结果。然而，仅在WT RHO和P23H组中，能量应激触发AMP激活蛋白激酶激活和代谢重编程以增加糖酵解。R135L和G188R组的代谢重编程障碍可能是这些组能量衰竭和细胞损伤更严重的原因。结论：我们的结果表明，RHO错义突变体的过表达对两种能量代谢途径有不同的影响，这可能与其异质性表型有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RHO突变如何影响光感受器细胞的能量代谢，以及代谢功能障碍是否与异质性表型相关？
- 核心机制
- RHO过表达导致线粒体丢失和OXPHOS缺陷，能量应激在WT和P23H组激活AMPK，促进GLUT1膜转位和葡萄糖摄取，增强糖酵解；R135L和G188R组AMPK激活及代谢重编程受损，导致更严重的能量衰竭和细胞损伤。
- 主要证据
- 661w细胞过表达WT RHO及突变体，检测OCR、ECAR、ATP水平、线粒体质量、ROS、钙水平、糖酵解限速酶活性及关键蛋白表达；使用抑制剂（Compound C, Ru265, 2-APB）验证机制；c-tail截短突变恢复OXPHOS。
- 研究意义
- 揭示了能量代谢功能障碍可能在RHO ADRP的发病机制中起关键作用，RHO突变对两种能量代谢途径的不同影响可能与其异质性表型相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测细胞能量状态和细胞死亡
评估RHO过表达对细胞能量产生和细胞存活的影响。
在转染后不同时间点（24, 36, 48, 60小时）检测ATP水平、ATP/ADP比值、细胞凋亡和坏死。
分析氧化磷酸化和糖酵解
比较各组OXPHOS和有氧糖酵解的差异，以确定代谢重编程是否发生。
使用Agilent Seahorse XFe24分析仪检测OCR和ECAR，评估线粒体呼吸和糖酵解功能。
检测线粒体功能和质量
确定OXPHOS缺陷是否由线粒体呼吸链抑制或线粒体丢失引起。
检测线粒体呼吸链复合物I-IV活性、Tom20蛋白水平、线粒体质量（MitoTracker Green）和线粒体ROS。
研究钙信号与线粒体丢失的关系
探讨细胞内钙超载是否导致线粒体丢失。
检测线粒体和细胞钙水平，使用Ru265抑制线粒体钙单向转运体，使用2-APB抑制细胞内钙释放，观察线粒体质量、能量状态和凋亡。
评估c-tail截短突变的影响
确定c-tail在RHO过表达毒性中的作用。
构建c-tail截短突变体（RHOΔC），检测能量状态、细胞凋亡、OCR/ECAR、线粒体质量、钙水平和亚细胞定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | N-乙酰半胱氨酸 | Selleck Chemicals | S1623 |
| 2-氨基乙基二苯基硼酸酯 | Selleck Chemicals | S6657 | |
| Ru265 | Sigma-Aldrich | SML2991 | |
| 化合物C | Sigma-Aldrich | P5499 | |
| 质粒构建 | KOD-Plus-诱变试剂盒 | Toyobo | SMK-101 |
| 转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | PRE2311 |
| 流式分析 | Annexin-V FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 |
| eBioscience钙传感器染料eFluor 514 | Thermo Fisher Scientific | 65-0859-70 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| MitoSOX | Thermo Fisher Scientific | M36008 | |
| Rhod-2 AM细胞渗透性 | Thermo Fisher Scientific | R1245MP | |
| 免疫荧光 | 抗视紫红质一抗 | Abcam | ab98887 |
| FITC标记的抗小鼠IgG | Rockland Immunochemicals | 610-102-121 | |
| 抗-Calnexin抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 抗兔IgG（H&L）（山羊）罗丹明偶联抗体 | Rockland Immunochemicals | 611-1022 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 能量代谢 | 发光ATP检测试剂盒 | Abcam | ab113849 |
| Tecan发光读数仪 | Tecan Group | -- | |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| ADP/ATP比值检测试剂盒（生物发光） | Abcam | ab65313 | |
| Agilent XF24细胞培养板 | Agilent | -- | |
| Agilent Seahorse XFe24分析仪 | Agilent | -- | |
| Agilent Seahorse XF基础培养基 | Agilent | 102353-100 | |
| 寡霉素A | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Agilent Seahorse XF糖酵解应激测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 葡萄糖 | -- | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| 线粒体检测 | 线粒体复合物I活性比色检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 琥珀酸脱氢酶活性比色检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 线粒体复合物III活性检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 细胞色素氧化酶活性比色检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 柠檬酸合酶活性比色检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 葡萄糖摄取 | Promega葡萄糖摄取-Glo检测试剂盒 | Promega | J1342 |
| 糖酵解酶活性 | 己糖激酶（HK）活性检测试剂盒 | BioVision | K789-100 |
| 磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒 | BioVision | K776-100 | |
| 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒 | BioVision | K726-500 | |
| 蛋白提取 | Abcam质膜蛋白提取试剂盒 | Abcam | ab65400 |
| 免疫印迹 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 |
| 抗PFKFB2抗体 | Abcam | ab234865 | |
| 抗GRP78抗体 | Abcam | ab21685 | |
| 重组抗葡萄糖转运蛋白GLUT1抗体 | Abcam | ab115730 | |
| Na+/K+ ATP酶抗体 | Cell Signaling Technology | 3010 | |
| 细胞色素c抗体 | Cell Signaling Technology | 4272 | |
| 裂解型caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Tom20抗体 | Cell Signaling Technology | 42406 | |
| 己糖激酶II抗体 | Cell Signaling Technology | 2867 | |
| 磷酸化PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 3827 | |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| LDHA抗体 | Cell Signaling Technology | 2012 | |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 磷酸化AMPKα (T172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗 | United Chemi-Con | AP132P | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗 | United Chemi-Con | AP308P | |
| 蛋白定量 | Tecan Spark酶标仪 | Tecan Group | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系：661w细胞；培养基：DMEM含10%胎牛血清；转染试剂：FuGENE HD；质粒：pcDNA3.1载体；转染时间：48小时 阅读提示：详见Materials and Methods中'Cell Culture and Chemicals'和'Plasmids and Transfection' |
| 能量代谢检测 | 检测时间：转染后48小时；试剂：Oligomycin A (1 µM), FCCP (1 µM), Rotenone (1 µM) + Antimycin A (1 µM)；糖酵解应激：葡萄糖 (1 µM), oligomycin (1 µM), 2-DG (1 µM) 阅读提示：详见Materials and Methods中'Bioenergetic Analyses'和'Seahorse Metabolism Analysis' |
| 线粒体质量与功能 | MitoTracker Green FM (0.1 µM)染色；MitoSOX (0.5 µM)；呼吸链复合物活性试剂盒；Tom20蛋白水平 阅读提示：详见Materials and Methods中'Flow Cytometry Analysis'和'Measurements of the Activities of Mitochondrial Respiratory Chain Complex I to IV' |
| 钙信号检测 | Rhod-2 AM (0.5 µM)；eFluor 514 (0.5 µM)；Ru265 (10 µM)；2-APB (10 µM) 阅读提示：详见Materials and Methods中'Flow Cytometry Analysis'和Results中'Mitochondrial Loss in RHO Overexpressed Cells Is Associated With Excessive Intracellular Calcium Release' |
| 糖酵解酶活性检测 | HK (K789-100), PFK (K776-100), PK (K709-100), LDH (K726-500)活性试剂盒；葡萄糖摄取检测试剂盒 (J1342) 阅读提示：详见Materials and Methods中'Glucose Uptake Assay'和'Measurement of the Activities of Rate-Limiting Glycolytic Enzymes' |