组织样本中U3 snoRNA表达检测
验证U3 snoRNA在翼状胬肉组织中的表达水平是否与正常结膜组织有差异。
通过RT-qPCR和原位杂交检测翼状胬肉组织和正常结膜组织中U3 snoRNA的表达和定位。
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非典型U3 snoRNA通过调节18S核糖体RNA合成抑制翼状胬肉进程
Atypical U3 snoRNA Suppresses the Process of Pterygium Through Modulating 18S Ribosomal RNA Synthesis
实验完整度
高包含原代细胞培养、功能获得与丧失实验、转录组与蛋白质组分析、体外机制验证等多层级证据，并进行了功能验证。
主要模型
人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs） 人结膜成纤维细胞（HCFs） 翼状胬肉患者组织样本
重点核对
U3 snoRNA在翼状胬肉组织中的表达显著低于正常结膜组织（log2FC = −4.33） 在HPFs中过表达U3 snoRNA或在HCFs中敲低U3 snoRNA后细胞增殖和迁移的变化 UV照射（100、200 mJ/cm²）和TGF-β处理（10、20、40 ng/mL）对HCFs中U3 snoRNA表达的影响 U3 snoRNA过表达或敲低后47S rRNA剪切位点A'和A0的变化及18S rRNA成熟度的变化 蛋白质组学分析中过表达和敲低U3 snoRNA后共同差异表达蛋白的鉴定
摘要
背景：翼状胬肉的进展和复发主要由于基质翼状胬肉成纤维细胞的异常增殖和迁移。本研究探讨小核仁RNA U3（U3 snoRNA）在翼状胬肉中的异常表达，并阐明U3 snoRNA在翼状胬肉发展中的分子机制。方法：从新鲜结膜移植物和翼状胬肉组织中分离并培养原代人结膜成纤维细胞（HCFs）和人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs）。分别使用PLKO.1慢病毒系统和CRISPR/Cas9重组构建体在HPFs和HCFs中过表达和沉默U3 snoRNA，以进行进一步的特定表型分析。利用RNA-seq和TMT标记定量蛋白质质谱评估U3 snoRNA对mRNA转录本和蛋白质合成的影响。结果：翼状胬肉中U3 snoRNA的减少促进HCF或HPF细胞的增殖、迁移和细胞周期进程，但对凋亡无显著影响。U3 snoRNA通过在前体核糖体RNA 47S rRNA的5'外部转录间隔区（5' ETS）剪切来调节18S rRNA合成。此外，U3 snoRNA的改变导致HCF或HPF细胞中mRNA和蛋白质的差异表达。结论：非典型U3 snoRNA通过调节18S rRNA合成，调节特定蛋白质的翻译，从而在翼状胬肉中发挥抑制作用。在此，我们揭示了U3 snoRNA生物学在翼状胬肉发展中的新见解。关键词：小核仁RNA U3（U3 snoRNA）、翼状胬肉、核糖体生物发生、18S核糖体RNA（18S rRNA）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- U3 snoRNA在翼状胬肉发生发展中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- 非典型U3 snoRNA通过结合47S rRNA的5' ETS区域，参与5' ETS的剪切，促进18S rRNA的成熟，进而调节核糖体生物发生和蛋白质翻译，从而抑制翼状胬肉成纤维细胞的增殖和迁移。
- 主要证据
- 原代HPFs和HCFs中过表达或敲低U3 snoRNA后细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的变化；RT-qPCR检测47S rRNA剪切和18S rRNA成熟度；RNA-seq和TMT蛋白质组学分析显示mRNA和蛋白质差异表达。
- 研究意义
- 揭示了U3 snoRNA在翼状胬肉发展中的新机制，为翼状胬肉的精准治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原代细胞分离与鉴定
获取并验证翼状胬肉成纤维细胞和正常结膜成纤维细胞，用于后续功能实验。
从手术切除的翼状胬肉和正常结膜组织中分离原代成纤维细胞，并通过免疫荧光检测波形蛋白和细胞角蛋白进行鉴定。
细胞功能实验
探究U3 snoRNA对成纤维细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。
在HPFs中过表达U3 snoRNA，在HCFs中敲低U3 snoRNA，通过CCK8、划痕实验、流式细胞术和Western blot检测细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期相关蛋白表达。
rRNA加工分析
验证U3 snoRNA是否参与47S rRNA的剪切和18S rRNA的成熟。
通过生物信息学预测U3 snoRNA与47S rRNA的结合位点，设计特异性引物，通过RT-qPCR检测5' ETS剪切和18S rRNA成熟度。
转录组和蛋白质组分析
探究U3 snoRNA对mRNA转录和蛋白质合成的影响。
对过表达U3 snoRNA的HPFs进行RNA-seq，对过表达和敲低U3 snoRNA的细胞进行TMT标记定量蛋白质质谱分析，并分析差异表达基因和蛋白的功能富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 细胞消化 | 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Gibco Life Technologies | -- |
| 基因转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 免疫荧光 | 曲拉通X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 波形蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC6260 | |
| 细胞角蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC58719 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 568标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA定量 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | RR047A |
| RT-qPCR | StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光底物 | Millipore | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | BioRad | -- | |
| Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 5023 | |
| Bcl2抗体 | Cell Signaling Technology | 4223 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Cell Signaling Technology | 55506 | |
| 细胞周期蛋白D3抗体 | Cell Signaling Technology | 2936 | |
| CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 13331 | |
| P21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 2586 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 58169 | |
| Ki67抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23900 | |
| 原位杂交 | 蛋白酶K | -- | -- |
| DIG标记的U3 snoRNA探针 | -- | -- | |
| NBT/BCIP底物 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pLKO.1载体 | Sigma-Aldrich | SHC001 |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)质粒 | Addgene | 48138 | |
| 流式分选 | 流式分选仪 | -- | -- |
| 统计分析 | SPSS软件 | -- | version |
| GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | 7.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本采集 | 患者年龄、性别、翼状胬肉分级、组织采集部位、样本量 阅读提示：Materials and Methods: Specimen Collection |
| 原代细胞培养 | 培养基成分、血清浓度、组织块大小、培养时间、传代代数、培养条件（湿度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Prepare Primary Human Conjunctival Fibroblasts and Pterygium Fibroblasts |
| U3 snoRNA表达检测 | RT-qPCR引物序列、内参基因、RNA提取方法、样本量 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative Reverse Transcription-PCR and Supplementary Table S2 |
| 细胞功能实验 | 过表达或敲低效率验证、细胞增殖检测方法（CCK-8）、划痕实验时间点、凋亡检测方法、细胞周期分析 阅读提示：Materials and Methods: Wound Healing Assay; Results: U3 snoRNA Suppresses the Proliferation and Migration of HPF Cells; U3 snoRNA Mainly Causes G0/G1 Phase Arrest, But Not Apoptosis in HPF Cells |
| rRNA加工分析 | 47S rRNA剪切位点（A'、A0）检测引物设计、18S rRNA成熟度检测引物、RT-qPCR条件 阅读提示：Results: U3 snoRNA Involves in the 47S rRNA Shearing and Maturation of 18S rRNA; Figure 5 |
| 组学分析 | RNA-seq文库构建方法、测序平台、数据分析流程、蛋白质组学定量方法、差异表达阈值 阅读提示：Results: U3 snoRNA Mainly Affects the Proteome Profile by Regulating the Ribosome Function in Pterygium; Data Availability |