PTGS2基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立
验证PTGS2基因敲除效率并产生用于体细胞核移植的供体细胞。
设计针对PTGS2外显子1的gRNA，克隆至pX330质粒，转染猪胎儿成纤维细胞，筛选出双等位基因编辑的细胞系CAP81（128-bp缺失）。
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敲除猪胚胎 PTGS2 表达不改变早期胚胎发育和妊娠的建立
Ablation of conceptus PTGS2 expression does not alter early conceptus development and establishment of pregnancy in the pig†
实验完整度
高包括CRISPR/Cas9基因编辑和体细胞核移植产生PTGS2敲除胚胎、体外囊胚培养和PG测定、胚胎移植至代孕母猪后在多个妊娠时间点分析胚胎形态、基因表达及妊娠维持。
主要模型
猪胎儿成纤维细胞（PTGS2+/+和PTGS2−/−）用于体细胞核移植 体细胞核移植产生的猪囊胚 移植胚胎的代孕母猪（妊娠第14、17和35天）
重点核对
PTGS2基因编辑效率（gRNA浓度4 μg） PTGS2−/−胚胎中PTGS2蛋白和mRNA表达的敲除效率 胚胎移植时受体母猪的发情周期阶段（第3、4或5天） 胚胎移植后妊娠第14、17和35天的回收时间点 概念组织培养的培养基组成和时间（3小时和12小时）
摘要
猪胚胎在滋养层快速伸长和妊娠建立期间分泌雌激素（E2）、白细胞介素1β2（IL1B2）和前列腺素（PGs）。先前的研究已确定IL1B2对于胚胎快速伸长是必需的，而E2对于胚胎伸长或黄体的早期维持并非必需。本研究的目的是确定胚胎前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）的表达和PG的释放是否对早期发育和妊娠建立重要。为了了解PTGS2在胚胎伸长和妊娠建立中的作用，通过使用CRISPR/Cas9技术编辑PTGS2进行了功能缺失研究。使用野生型（PTGS2+/+）和敲除（PTGS2−/−）成纤维细胞通过体细胞核移植创建胚胎。在第7天培养的PTGS2−/−囊胚中，PTGS2的免疫定位和PG产生缺失。将PTGS2+/+和PTGS2−/−囊胚移植到代孕母猪中，并在妊娠第14、17或35天收集生殖道。在第14和17天冲洗子宫后，将丝状胚胎培养3小时以测定PG的产生。与PTGS2+/+胚胎相比，PTGS2−/−胚胎在培养基中释放的总PG、前列腺素F2α（PGF2α）和PGE较低。然而，子宫冲洗液中的总PG、PGF2α和PGE含量没有差异。允许继续妊娠的PTGS2−/−胚胎代孕母猪维持妊娠超过30天。这些结果表明，猪胚胎PTGS2对于猪早期发育和妊娠建立并非必需。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 猪胚胎PTGS2表达和前列腺素释放是否对早期胚胎发育和妊娠建立至关重要？
- 核心机制
- 基于PTGS2缺失导致胚胎前列腺素合成减少但妊娠仍可维持，提示胚胎前列腺素对于早期母体妊娠识别并非必需，可能由其他途径（如雌激素）补偿。
- 主要证据
- 通过CRISPR/Cas9产生的PTGS2−/−猪胚胎，在体外和体内均显示前列腺素产生显著减少，但胚胎发育和妊娠维持至35天未受影响。
- 研究意义
- 该研究证明猪胚胎PTGS2来源的前列腺素对于早期发育和妊娠建立不必要，为理解母猪妊娠识别的机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
通过体细胞核移植产生PTGS2−/−和PTGS2+/+胚胎
产生基因型确定的胚胎以评估PTGS2对早期发育的影响。
以PTGS2−/−（CAP81）和PTGS2+/+的成纤维细胞作为供体，进行体细胞核移植，体外培养至囊胚阶段。
体外培养囊胚的PTGS2表达和前列腺素产生分析
验证PTGS2敲除在蛋白和功能水平的效果。
第7天囊胚进行免疫荧光检测PTGS2定位，收集培养液测定总前列腺素含量。
胚胎移植和妊娠早期回收（第14和17天）
评估PTGS2−/−胚胎在体内早期发育和妊娠建立的能力。
将PTGS2+/+和PTGS2−/−囊胚移植到代孕母猪，分别在第14和17天收集生殖道，冲洗子宫获取胚胎和子宫液。
妊娠第35天胎盘和胎儿评估
评估PTGS2−/−胚胎长期维持妊娠和胎盘发育的能力。
允许代孕母猪继续妊娠至35天，剖检收集胎盘和胎儿，分析形态和基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑
胚胎生产
组织学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR/Cas9质粒构建 | pX330质粒 | Addgene | -- |
| PCR纯化 | PureLink PCR纯化试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K310001 |
| 载体克隆 | pCR4-TOPO TA载体 | ThermoFisher Scientific | 450071 |
| 体细胞核移植电融合 | BTX细胞电融合仪 | Harvard Apparatus | -- |
| 胚胎培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | ThermoFisher Scientific | 11995-065 |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| 前列腺素检测 | 前列腺素筛选ELISA试剂盒 | Cayman Chemical Company | 514012 |
| 酶标仪 | EL808超微板读数仪 | Bio-Tek | -- |
| RNA提取 | TRIzol-RNA裂解试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596018 |
| RNA纯化 | Direct-zol RNA小提Plus试剂盒 | Zymo Research | R2070 |
| RNA/DNA/蛋白提取 | AllPrep DNA/RNA/蛋白小提试剂盒 | Qiagen | 80004 |
| DNA去除 | 无RNase DNase套装 | Qiagen | 79256 |
| RNA/DNA质量检测 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 逆转录 | iScript RT超混合液 | Bio-Rad | 1708841 |
| RT-qPCR | CFX384实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白浓度测定 | Qubit 4荧光计 | Invitrogen | -- |
| Western blot凝胶 | Mini Protean TGX预制蛋白凝胶 | Bio-Rad | 4561096 |
| Western blot转膜 | iBlot转印叠，PVDF膜 | ThermoFisher Scientific | IB401001 |
| Western blot成像 | Fotodyne成像系统 | Fisher Scientific | F71720DLN |
| Western blot底物 | Pierce ECL 2 Western blot底物 | ThermoFisher Scientific | 80196 |
| Western blot一抗 | 抗PTGS2抗体 | Cayman Chemicals | 160107 |
| Western blot二抗 | 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，HRP | Invitrogen | 31466 |
| Western blot内参抗体 | 小鼠THE α-微管蛋白抗体 | GenScript | A01410 |
| 蛋白分析软件 | Fiji Is Just ImageJ | -- | -- |
| IL1B检测 | 猪IL1B ELISA试剂盒 | Abcam | 100754 |
| 前列腺素提取 | Oasis MAX uElution板 | Waters Corp. | -- |
| 质谱分析 | Waters Xevo TQ-S微三连四极杆质谱仪 | Waters Corp. | -- |
| 液相色谱 | Waters Acquity I-Class超高效液相色谱 | Waters Corp. | -- |
| 色谱柱 | Acquity PFP色谱柱 | Waters Corp. | -- |
| 免疫荧光二抗 | Alexa Fluor Plus 488标记二抗 | ThermoFisher Scientific | A-32731 |
| 免疫荧光核染色 | Hoescht荧光染料33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 |
| 封片剂 | VectaShield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 |
| 荧光显微镜 | Leica DM5500 B正置荧光显微镜 | Leica | -- |
| 荧光显微镜相机 | Leica DFC450 C相机 | Leica | -- |
| 图像分析软件 | Leica应用套件X | Leica | -- |
| 抗原修复 | Reveal Decloaker 10x抗原修复液 | Biocare Medical | RV1000M |
| 免疫组化一抗 | 抗COX-2（小鼠）多克隆抗体 | Cayman Chemical | 160106 |
| 安乐死 | Euthasol | Virbac AH, Inc | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因编辑 | gRNA设计, 浓度（4 μg）, 转染和筛选方法 阅读提示：Materials and Methods: CRISPR/Cas9 design and transfection of porcine fetal fibroblast cells |
| 体细胞核移植 | 供体细胞类型和状态, 卵母细胞来源, 融合参数 (1.2 kV/cm, 30 μs), 培养条件 阅读提示：Materials and Methods: Somatic cell nuclear transfer |
| 胚胎移植 | 受体母猪的年龄、体重, 发情周期阶段, 移植胚胎数量 (30-50), 移植部位 阅读提示：Materials and Methods: Embryo transfer |
| 胚胎回收 | 妊娠天数 (14, 17, 35), 子宫冲洗方法 (2×30 mL PBS), 概念组织培养条件 (DMEM, 5% O2/5% CO2, 37°C), 采样时间点 (3h, 12h) 阅读提示：Materials and Methods: Embryo collection |
| 前列腺素测定 | ELISA试剂盒, 质谱方法, 培养液和子宫冲洗液的处理与储存 阅读提示：Materials and Methods: Measurement of blastocyst and conceptus prostaglandin production; Prostaglandins assay |
| 基因表达分析 | RNA提取和纯化方法, RT-qPCR条件, 引物序列, 内参基因 (YWHAG) 阅读提示：Materials and Methods: Total RNA, genomic DNA, and protein isolation; Reverse transcription and RT-PCR gene expression analysis |
| 蛋白表达分析 | 蛋白定量, 上样量 (20 μg), 凝胶类型, 转膜方法, 抗体稀释度 (anti-PTGS2 1:500) 阅读提示：Materials and Methods: Western blot analysis |
| 免疫组化 | 固定方法, 抗原修复, 抗体稀释度 (anti-COX-2 1:250), 荧光二抗和核染色 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry |