类器官建立及激素处理
建立人子宫内膜上皮类器官模型，并在无WNT激活因子的条件下模拟月经周期类固醇激素和PGE2环境，以研究其对腺体功能的影响。
将人子宫内膜上皮细胞接种于Matrigel中，在扩增培养基中培养4天，随后第4天开始用E2处理2天，第6天更换为基础培养基，并用对照、E2、E2+MPA、MPA、MPA+PGE2处理6天，每2天换液。
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人子宫内膜上皮类器官的基底外侧分泌物影响基质细胞蜕膜化
Basolateral secretions of human endometrial epithelial organoids impact stromal cell decidualization
实验完整度
高包含类器官转录组和蛋白质组分析、体外基质细胞蜕膜化功能验证及免疫荧光等，证据层级独立。
主要模型
人子宫内膜上皮类器官 原代人子宫内膜基质细胞
重点核对
类器官培养及激素处理方案（图1A） 类器官基底外侧分泌蛋白的质谱分析条件 基质细胞蜕膜化诱导及CST3处理条件（图4A，图5A） 蜕膜化标志基因检测（PRL、IGFBP1等）
摘要
子宫腺体及其分泌物影响子宫容受性、囊胚着床、基质细胞蜕膜化和胎盘发育。月经周期中腺体功能的变化主要受类固醇激素雌激素（E2）和孕酮（P4）调控，但也可能受到基质来源的外在因素影响。利用人子宫内膜上皮类器官系统，转录组和蛋白质组分析确定了类器官对类固醇激素和前列腺素E2（PGE2）的独特反应。值得注意的是，P4和PGE2调节了类器官蛋白质的基底外侧分泌，特别是胱抑素C（CST3）、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族A成员3（SERPINA3）和斯钙素1（STC1）。CST3，而非SERPINA3或STC1，减弱了类固醇激素和PGE2诱导的体外基质细胞蜕膜化反应。这些发现提供了子宫腺体来源因子影响基质细胞蜕膜化的证据，这对女性妊娠建立和生育能力具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 子宫腺体衍生的基底外侧分泌蛋白是否以及如何影响基质细胞蜕膜化？
- 核心机制
- CST3，一种由腺上皮分泌的蛋白酶抑制剂，以浓度依赖方式减弱类固醇激素和PGE2诱导的基质细胞蜕膜化，可能通过抑制半胱氨酸蛋白酶活性来调节蜕膜化程度。
- 主要证据
- 人子宫内膜上皮类器官的转录组和蛋白质组分析显示P4和PGE2调节CST3等蛋白的基底外侧分泌；原代基质细胞实验中，1000 ng/ml CST3显著降低PRL和IGFBP1 mRNA水平，表明其抑制蜕膜化。
- 研究意义
- 这些发现强调了腺体-基质串扰在调节蜕膜化中的重要性，为理解妊娠建立和女性生育能力提供了新见解，并表明子宫内膜上皮类器官可用于研究着床窗口期的子宫内膜功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
类器官转录组分析
鉴定激素和PGE2处理对类器官基因表达的影响，以揭示腺体对激素的响应。
提取激素处理后的类器官RNA，进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，并进行GO和KEGG通路富集分析。
类器官基底外侧分泌蛋白质组分析
鉴定激素和PGE2处理下类器官基底外侧分泌的蛋白，并筛选可能影响基质细胞的候选因子。
收集处理后的类器官培养基，进行质谱分析（DIA），比较各处理组与对照的蛋白丰度变化。
候选蛋白对基质细胞蜕膜化的影响
验证类器官分泌蛋白（CST3、STC1、SERPINA3）是否影响人子宫内膜基质细胞的蜕膜化。
原代基质细胞先用E2+MPA处理6天，然后加入cAMP、PGE2或不同浓度的重组蛋白（CST3、STC1、SERPINA3）处理4天，通过RT-qPCR检测蜕膜化标志基因表达。
CST3对PGE2诱导蜕膜化的影响验证
进一步验证CST3是否抑制PGE2诱导的基质细胞蜕膜化。
将基质细胞先用E2+MPA处理6天，然后加入PGE2及不同浓度CST3处理4天，检测PRL和IGFBP1 mRNA水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 11320-033 |
| 活性炭处理胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15240-062 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| 激素处理 | 雌二醇 | Sigma | E1024 |
| 醋酸甲羟孕酮 | Sigma | PHR1589 | |
| 前列腺素E2 | Sigma | P0409 | |
| 免疫荧光 | Hoechst染料 | Invitrogen | H3570 |
| RNA提取 | Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | R2070 |
| 逆转录 | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | 1708841 |
| qPCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白质定量 | Pierce 660nm蛋白质定量试剂 | Pierce Chemical | -- |
| 质谱分析 | Bruker timsTOF PRO质谱仪 | Bruker | -- |
| 重组蛋白处理 | 重组人胱抑素C | R&D Systems | 1196-PI-010 |
| 重组人斯钙素1 | R&D Systems | 9400-SO-050 | |
| 重组人α1-抗胰凝乳蛋白酶 | R&D Systems | 1295-PI-010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养与激素处理 | 类器官培养时间、激素处理浓度、处理时长、激素组合（E2、MPA、PGE2） 阅读提示：Methods：Establishment and maintenance of human organoid and primary endometrial stromal cultures；Hormone treatment of organoids；图1A |
| 转录组分析 | RNA-seq文库构建方法、测序平台、差异基因筛选标准（fold change、P值） 阅读提示：Methods：RNA-seq transcriptome analysis |
| 蛋白质组分析 | 样品收集方式、蛋白提取方法、质谱仪器型号、DIA参数、差异蛋白筛选标准 阅读提示：Methods：Mass spectrometry analysis of basolateral secretion of organoid proteins |
| 基质细胞蜕膜化功能验证 | 基质细胞来源、培养条件、激素处理（E2+MPA）、诱导剂（cAMP、PGE2）、重组蛋白浓度（10, 100, 1000 ng/ml）、处理时间、检测标志物（PRL, IGFBP1等） 阅读提示：Methods：Culture and treatment of primary human endometrial stromal cells；图4A和图5A |