模型建立与高糖培养
建立模拟高血糖的体外Vγ9Vδ2 T细胞培养系统
从健康供者PBMCs中分离细胞，在含IL-2和帕米膦酸条件下，分别用正常（5.5 mM）或高糖（22 mM）培养14天，获得NG-和HG-Vγ9Vδ2 T细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
葡萄糖代谢调控人γδ T细胞在糖尿病中的肿瘤免疫监视
Glucose metabolism controls human γδ T-cell-mediated tumor immunosurveillance in diabetes
实验完整度
高包含体外细胞实验（高糖培养、细胞毒性、代谢分析）、体内小鼠模型（A549异种移植）及患者样本验证，并利用药物干预（二甲双胍、AMPK激活剂/抑制剂）进行功能验证。
主要模型
Vγ9Vδ2 T细胞 Rag2−/−γc−/−小鼠A549肿瘤模型 T2DM患者外周血样本
重点核对
Vγ9Vδ2 T细胞在高糖（22 mM）与正常糖（5.5 mM）条件下培养14天 使用K562等肿瘤细胞作为靶细胞，效靶比10:1共培养6小时 二甲双胍处理浓度20 μM，处理12小时 AMPK激活剂Compound 991（20 μM，2小时）和抑制剂Compound C（20 μM，6小时）处理 小鼠模型中，Rag2−/−γc−/−小鼠皮下接种GFP+ A549细胞（0.1×10^6/只），并给予10%葡萄糖水
摘要
2型糖尿病（T2DM）患者患癌症的风险增加。葡萄糖代谢对γδ T细胞的影响及其对肿瘤监视的影响仍不清楚。本文研究表明，高糖在Vγ9Vδ2 T细胞中诱导Warburg效应型的生物能量谱，导致乳酸过度积累，进而通过抑制AMPK激活来损害溶细胞颗粒的分泌，从而抑制溶细胞机制向Vγ9Vδ2 T细胞-肿瘤突触的运输，并在体外、体内和患者中导致抗肿瘤活性丧失。值得注意的是，通过血糖控制或二甲双胍治疗激活AMPK通路可逆转代谢异常并恢复Vγ9Vδ2 T细胞的抗肿瘤活性。这些结果表明，由糖代谢失调诱导的Vγ9Vδ2 T细胞抗肿瘤活性受损可能有助于T2DM患者癌症风险的增加，并且通过二甲双胍靶向AMPK通路进行代谢重编程可能改善肿瘤免疫监视。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高血糖是否以及如何影响Vγ9Vδ2 T细胞的抗肿瘤活性，并探索其在T2DM相关癌症风险中的作用？
- 核心机制
- 高糖通过诱导Vγ9Vδ2 T细胞Warburg效应，增加乳酸分泌，乳酸通过抑制AMPK激活，阻碍穿孔素/MTOC向肿瘤突触极化，从而抑制溶细胞颗粒分泌，导致抗肿瘤活性下降。
- 主要证据
- 体外高糖培养模型、Rag2−/−γc−/−小鼠体内模型、T2DM患者样本，以及AMPK激活剂/抑制剂、二甲双胍和乳酸处理的干预实验。
- 研究意义
- 揭示了高血糖通过损害γδ T细胞抗肿瘤活性促进T2DM相关癌症风险的机制，并提出二甲双胍通过激活AMPK通路改善肿瘤免疫监视的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗肿瘤活性检测
检测高糖对Vγ9Vδ2 T细胞杀伤肿瘤细胞能力的影响
纯化的NG-和HG-Vγ9Vδ2 T细胞与多种肿瘤细胞系共培养，通过流式检测靶细胞死亡（PI染色）和CD107a表达。
溶细胞颗粒分泌分析
确定高糖抑制Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能的机制
共培养后收集上清，用流式细胞术检测穿孔素、颗粒酶A/B、颗粒溶素的分泌，同时检测细胞内表达和突触形成。
代谢表型分析
分析高糖对Vγ9Vδ2 T细胞糖酵解和氧化磷酸化的影响
采用海马代谢分析仪检测ECAR和OCR，评估糖酵解和线粒体功能参数。
AMPK通路与乳酸机制验证
验证乳酸抑制AMPK激活并介导高糖效应
检测NG-、HG-和HG→NG-Vγ9Vδ2 T细胞中p-AMPK表达，并外源添加乳酸或LDHA抑制剂GSK处理，检测AMPK活性和细胞毒性。
葡萄糖控制与药物干预
评估葡萄糖恢复和二甲双胍对高糖损伤的逆转作用
将HG-Vγ9Vδ2 T细胞转至正常糖培养12小时（HG→NG），或用二甲双胍（20 μM，12小时）处理，检测AMPK激活、穿孔素极化、溶颗粒分泌和细胞毒性。
体内验证
在动物模型中验证高糖抑制γδ T细胞抗肿瘤作用及葡萄糖控制的作用
Rag2−/−γc−/−小鼠皮下接种GFP+ A549细胞，并给予正常或高糖饮水。在第7,12,17,22天静脉注射NG-、HG-、HG→NG-Vγ9Vδ2 T细胞，监测肿瘤生长和生存期。
患者样本验证
验证T2DM患者中γδ T细胞的抗肿瘤缺陷及乳酸、AMPK变化
收集T2DM患者和健康对照的PBMCs，检测Vγ9Vδ2 T细胞数量、CD107a表达、血清乳酸水平、AMPK表达及突触形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Vγ9Vδ2 T细胞制备 | 重组人IL-2 | Invitrogen | 11360832 |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | R1383 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 细胞毒性实验 | TCR γ/δ+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130092892 |
| 抗CD3单克隆抗体 | Biolegend | 300330 | |
| 抗Vδ2单克隆抗体 | Biolegend | 331418 | |
| Compound 991 | AOBIOUS | AOB8150 | |
| Compound C | Calbiochem | 171260 | |
| GSK（LDHA抑制剂） | Tocris Bioscience | 2837808A | |
| 流式细胞术 | 抗NKG2D单克隆抗体 | Biolegend | 320820 |
| 抗NKG2A单克隆抗体 | Beckman | IM3291U | |
| 抗TRAIL单克隆抗体 | Biolegend | 308206 | |
| 抗Fas单克隆抗体 | BD | 555673 | |
| 抗FasL单克隆抗体 | Biolegend | 306407 | |
| 抗PD-1单克隆抗体 | Invitrogen | 12-2799-42 | |
| 抗穿孔素单克隆抗体 | Biolegend | 308104 | |
| 抗颗粒酶A单克隆抗体 | Biolegend | 507206 | |
| 抗颗粒酶B单克隆抗体 | BD Biosciences | 561142 | |
| 抗IFN-γ单克隆抗体 | Biolegend | 502528 | |
| 抗TNF-α单克隆抗体 | BD Biosciences | 340511 | |
| CFSE染色 | CFSE | Sigma | 21888 |
| Ki67染色 | 抗Ki67单克隆抗体 | Biolegend | 350508 |
| 流式细胞术多因子检测 | 人CD8/NK多因子检测试剂盒（13因子） | Biolegend | 740267 |
| 免疫染色与显微镜 | Triton X-100 | Sigma | 11332481001 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7030 | |
| 抗人TCR γ/δ单克隆抗体 | Biolegend | 331202 | |
| 小鼠抗人穿孔素单克隆抗体 | BD Biosciences | 556434 | |
| 二抗（Alexa Fluor） | Invitrogen | A-21121 | |
| 鬼笔环肽 | Invitrogen | A22287 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5046 | |
| ProLong Gold防淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | P36931 | |
| Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫印迹 | Pierce RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78410 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1620115 | |
| 磷酸化AMPKα (Thr172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 5831 | |
| 磷酸化乙酰辅酶A羧化酶 (Ser79)抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3676 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Immobilon Classico Western HRP底物 | MERCK | WBLUC0500 | |
| SignalFire Plus ECL试剂 | Cell Signaling Technology | 12630 | |
| 代谢分析 | Seahorse XF-96细胞外通量分析仪 | Agilent | -- |
| XF基础RPMI海马培养基 | Agilent | -- | |
| 乳酸检测 | 乳酸比色/荧光检测试剂盒 | BioVision | K607-100 |
| 乳酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Vγ9Vδ2 T细胞制备 | PBMCs来源、培养基、葡萄糖浓度（正常5.5 mM vs 高糖22 mM）、IL-2浓度（200 IU/ml）、帕米膦酸浓度（6 µg/ml）、培养时间（14天） 阅读提示：见Materials and Methods中“Vγ9Vδ2 T-cell preparation” |
| 细胞毒性实验 | 靶细胞类型（如K562）、效靶比（10:1）、共培养时间（6小时）、检测方法（PI染色、CD107a表达） 阅读提示：见Materials and Methods中“Cytotoxic assay”和Figure 1 legend |
| 代谢分析 | Seahorse实验条件：培养基成分（10 mM葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠）、代谢抑制剂浓度（1 µM寡霉素、50 mM 2-DG、0.5 µM FCCP、0.5 µM鱼藤酮/抗霉素A） 阅读提示：见Materials and Methods中“Seahorse metabolic flux analysis” |
| AMPK通路验证 | 乳酸处理浓度（2.5-30 mM）和处理时间（2、6小时）、GSK浓度（20 µM）和处理时间（6小时）、AMPK激活剂/抑制剂浓度和处理时间（Compound 991 20 µM 2小时；Compound C 20 µM 6小时） 阅读提示：见Materials and Methods中“Immunoblotting”和Figure 5、6 legends |
| 体内实验 | 小鼠品系（Rag2−/−γc−/−，6-8周龄）、肿瘤细胞系（GFP+ A549，0.1×10^6/只）、T细胞注射次数和时间（第7,12,17,22天）、细胞剂量（10×10^6/只）、葡萄糖水浓度（10%）、对照组（PBS） 阅读提示：见Materials and Methods中“Mice”和Figure 3 legend |