建立耐药细胞系模型
建立获得性西妥昔单抗和顺铂耐药的头颈部鳞状细胞癌细胞系模型。
通过逐步增加药物浓度，从 PE/CA-PJ49 和 FaDu 细胞系中筛选出西妥昔单抗耐药克隆；从 PE/CA-PJ49 和 CAL33 细胞系中筛选出顺铂耐药克隆。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
获得性西妥昔单抗耐药的头颈部鳞状细胞癌模型中 PD-L1 通过 BRD2 上调
PD-L1 is upregulated via BRD2 in head and neck squamous cell carcinoma models of acquired cetuximab resistance
实验完整度
中研究包含体外细胞系模型实验，涉及表达检测、药物处理、基因敲低和染色质免疫沉淀，并包含功能验证，但缺少动物模型或患者样本等独立证据层级。
主要模型
PE/CA-PJ49 西妥昔单抗耐药细胞系 FaDu 西妥昔单抗耐药细胞系 PE/CA-PJ49 顺铂耐药细胞系 CAL33 顺铂耐药细胞系
重点核对
西妥昔单抗耐药克隆的生成 JQ1 的处理浓度和时间 MZ1 的处理浓度和时间 siRNA 转染的浓度和时间 CD274 启动子 ChIP 富集分析
摘要
背景：对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂或顺铂耐药的肿瘤模型表达更高水平的免疫检查点分子 PD-L1。我们试图确定在获得性西妥昔单抗耐药的头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 模型中 PD-L1 表达是否升高，以及其表达是否受溴结构域和末端外结构域 (BET) 蛋白的调控。方法：在获得性西妥昔单抗耐药的 HNSCC 细胞系模型中评估了 PD-L1 的表达。使用蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 和 RNAi 介导的靶向方法来评估 BET 蛋白的作用。结果：与西妥昔单抗敏感对照相比，西妥昔单抗耐药的 HNSCC 细胞表达升高的 PD-L1。使用 BET 抑制剂 JQ1、BET PROTAC MZ1 或 RNAi 介导的 BRD2 敲低可降低 PD-L1 表达。BRD2 的敲低也降低了获得性顺铂耐药模型中观察到的升高的 PD-L1 水平。结论：在获得性西妥昔单抗和顺铂耐药的 HNSCC 模型中，PD-L1 显著升高，其中 BRD2 是主要调控因子。关键词：西妥昔单抗耐药，PD-L1 上调，BRD2，BET
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 获得性西妥昔单抗耐药的头颈部鳞状细胞癌模型是否表达升高的 PD-L1，以及该表达是否受 BET 蛋白调控。
- 核心机制
- 在获得性西妥昔单抗和顺铂耐药的头颈部鳞状细胞癌模型中，BRD2 是调控 PD-L1 表达的主要 BET 蛋白。
- 主要证据
- 西妥昔单抗耐药细胞系中 PD-L1 表达升高；使用 BET 抑制剂 JQ1、BET PROTAC MZ1 或 RNAi 敲低 BRD2 可降低 PD-L1 表达；ChIP 分析显示 BRD2 在 CD274 启动子上的富集增加。
- 研究意义
- 靶向 BRD2/PD-L1 通路可能通过肿瘤内在和外在机制逆转西妥昔单抗耐药，但需要进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测耐药模型中 PD-L1 表达水平
评估耐药模型与亲本细胞相比 PD-L1 表达水平的变化。
通过免疫印迹、qRT-PCR 和流式细胞术检测 PD-L1 蛋白和 mRNA 水平。
评估 BET 抑制对 PD-L1 表达的影响
探究 BET 蛋白抑制是否能降低耐药细胞中 PD-L1 的表达。
使用 BET 抑制剂 JQ1 和 BET PROTAC MZ1 处理亲本和耐药细胞，通过免疫印迹检测 PD-L1 表达。
鉴定调控 PD-L1 表达的具体 BET 蛋白
确定调控 PD-L1 表达的具体 BET 家族成员。
使用 siRNA 敲低 BRD2 或 BRD4，通过免疫印迹、流式细胞术和 qRT-PCR 检测 PD-L1 表达；通过染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测 BET 蛋白在 CD274 启动子上的富集。
验证 BRD2 对顺铂耐药模型中 PD-L1 的调控
验证 BRD2 是否也调控顺铂耐药细胞中 PD-L1 的表达。
在顺铂耐药细胞中转染 BRD2 或 BRD4 siRNA，通过免疫印迹检测 PD-L1 表达，并用 JQ1 处理验证 BET 抑制效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Fisher | -- |
| 胎牛血清 | Gemini Bio products | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | -- | |
| 药物处理 | JQ1 | -- | -- |
| MZ1 | Tocris Bioscience | -- | |
| 流式分析 | PD-L1/PE-Cy7 抗体 | Biolegend | -- |
| PE-Cy7 同型对照 | Biolegend | -- | |
| Western blot | PD-L1 抗体 | CST | 13684 |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab6276 | |
| BRD4 抗体 | Abcam | 128874 | |
| BRD2 抗体 | CST | 5848 | |
| 蛋白去糖基化 | PNGaseF | New England BioLabs | -- |
| RT-qPCR | RNAeasy 试剂盒 | Qiagen | -- |
| iSCRIPT cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SYBR Green 预混液 | Bio-Rad | -- | |
| Bio-Rad CFX96 循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| RNA 干扰 | Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | -- |
| 染色质免疫沉淀 | Active Motif 试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| IgG 抗体 | CST | 3900 | |
| BRD2 抗体 | Active Motif | 61797 | |
| BRD3 抗体 | Active Motif | 61489 | |
| BRD4 抗体 | Active Motif | 39909 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | 西妥昔单抗耐药克隆的生成方法、顺铂耐药克隆的生成方法、处理浓度和时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell Lines and Reagents |
| 药物处理 | JQ1 和 MZ1 的处理浓度、处理时间 阅读提示：Results: BET inhibition suppresses PD-L1 expression |
| RNA 干扰 | siRNA 转染浓度、转染时间、siRNA 序列 阅读提示：Materials and Methods: RNA interference |
| 染色质免疫沉淀 | 细胞固定方法、抗体使用量、CD274 启动子引物序列 阅读提示：Materials and Methods: Chromatin Immunoprecipitation |