临床样本收集与基线特征分析
比较子宫腺肌症患者与对照组的基本临床特征，并收集子宫内膜和肌层组织样本用于后续分析。
入组40例子宫腺肌症患者和35例对照组，收集内膜和肌层组织，记录年龄、BMI、孕产次、流产史、CA125水平、子宫大小等。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
METTL3介导的m6A修饰通过GPX4以YTHDF1依赖性方式促进子宫腺肌症中的铁死亡
METTL3-mediated m6A modification promotes ferroptosis in adenomyosis through GPX4 in a YTHDF1-dependent manner
实验完整度
高包含临床样本分析、原代细胞体外实验、MeRIP-seq、RIP-qPCR及小鼠体内模型，涵盖表型、机制和功能验证。
主要模型
原代子宫内膜基质细胞（EuESCs） 他莫昔芬诱导的子宫腺肌症小鼠模型 子宫腺肌症患者子宫内膜和肌层组织
重点核对
METTL3敲低或过表达对铁死亡的影响（使用siRNA和过表达质粒） 铁死亡诱导剂erastin（10 μM）和抑制剂ferrostatin-1（1 μM）的处理 GPX4 mRNA m6A修饰位点突变（位点193、625、744） 动物实验中erastin（40 mg/kg）、ferrostatin-1（5 mg/kg）和STM2457（50 mg/kg）的腹腔注射 他莫昔芬诱导子宫腺肌症小鼠模型的给药方案（1 mg/kg，出生后第2至5天）
摘要
子宫腺肌症是一种常见的妇科疾病，影响育龄女性，其特征是子宫内膜组织异位存在于子宫肌层内。铁死亡在子宫腺肌症中的参与及其潜在机制尚未完全阐明。最近，m6A RNA修饰被发现调节多种生物过程。本研究旨在调查子宫腺肌症中铁死亡的状态，并探讨m6A修饰如何调节与铁死亡相关的关键基因。研究揭示，子宫腺肌症患者的在位和异位子宫内膜组织均存在铁死亡。此外，观察到RNA m6A修饰水平下降和GPX4蛋白表达减少。GPX4可能作为反映子宫腺肌症严重程度的生物标志物，因为它与患者的CA125水平、子宫大小和痛经严重程度呈显著负相关。在机制上，研究表明子宫内膜基质细胞中METTL3的下调导致GPX4 mRNA上的m6A修饰减少。因此，GPX4 mRNA的翻译被YTHDF1下调，导致在位和异位子宫内膜细胞发生铁死亡。这些发现有助于更深入地理解子宫腺肌症的潜在机制，并为靶向铁死亡治疗子宫腺肌症提供有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 子宫腺肌症中是否发生铁死亡，以及m6A修饰如何调控铁死亡相关关键基因（如GPX4）的表达。
- 核心机制
- METTL3下调导致GPX4 mRNA的m6A修饰减少，进而降低YTHDF1对GPX4 mRNA的结合，抑制GPX4 mRNA翻译，最终诱发铁死亡。
- 主要证据
- 临床样本显示GPX4蛋白降低而mRNA不变，METTL3敲低增加ROS和MDA水平，MeRIP-seq显示GPX4 m6A峰降低，YTHDF1 RIP-qPCR证实结合减少，突变m6A位点降低GPX4蛋白表达，小鼠模型证实铁死亡或METTL3抑制加重疾病。
- 研究意义
- 为靶向铁死亡治疗子宫腺肌症提供理论基础，并提示GPX4可作为疾病严重程度的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测铁死亡相关指标
评估子宫腺肌症组织中铁死亡是否发生。
利用透射电镜观察线粒体形态，检测MDA水平和铁离子含量，进行普鲁士蓝染色。
评估GPX4和METTL3表达水平
比较子宫腺肌症与对照组织中GPX4和METTL3的mRNA和蛋白表达差异。
通过RT-qPCR、Western blot和免疫组化检测GPX4和METTL3的表达。
细胞实验验证METTL3调控铁死亡
验证METTL3对子宫内膜基质细胞铁死亡的影响。
在原代EuESCs中敲低或过表达METTL3，检测细胞活力、ROS水平、MDA含量和GPX4表达。
阐明m6A修饰调控GPX4的机制
确定METTL3介导的m6A修饰如何影响GPX4表达。
使用MeRIP-seq和MeRIP-qPCR分析m6A修饰，RIP-qPCR验证YTHDF1结合，突变GPX4 m6A位点验证功能。
小鼠体内模型验证
在体内验证铁死亡和METTL3在子宫腺肌症中的作用。
用他莫昔芬诱导子宫腺肌症小鼠模型，分组给予erastin、ferrostatin-1或STM2457治疗，观察子宫病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织固定与切片 | 锇酸 | -- | -- |
| MDA含量测定 | 丙二醛含量检测试剂盒 | Sangon Biotech | D799762 |
| 铁含量测定 | 铁检测试剂盒 | Dojindo | I291 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗METTL3抗体 | Proteintech | 15073-1-AP | |
| 抗GPX4抗体 | Proteintech | 67763-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗波形蛋白抗体 | Servicebio | GB121308 |
| 抗细胞角蛋白1抗体 | Servicebio | GB111017 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA-seq | RNA片段化试剂 | Ambion | AM8740 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 铁死亡诱导 | erastin | MCE | HY-15763 |
| 铁死亡抑制 | ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 |
| METTL3抑制 | STM2457 | MCE | HY-134836 |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beiotime | S0033S |
| MeRIP | 抗m6A抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| RNA-seq | KAPA链特异性mRNA测序试剂盒 | Roche | -- |
| RIP | 抗YTHDF1抗体 | Proteintech | 17479-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者入组标准、样本来源组织类型（子宫内膜/肌层）、对照组选择 阅读提示：Materials and methods: Study design |
| 铁死亡指标检测 | MDA检测试剂盒、铁离子检测试剂盒、样本处理方式 阅读提示：Materials and methods: Measurement of MDA, Measurement of iron content |
| western blot | 抗体来源、稀释比例、封闭条件和成像系统 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 细胞实验 | 原代细胞分离方法、培养条件、转染试剂及浓度、药物处理浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, RNA interference and overexpression, Flow cytometry |
| MeRIP-seq和RIP-qPCR | 起始RNA量、抗体、片段化条件、免疫沉淀条件、qPCR引物 阅读提示：Materials and methods: MeRIP-seq and MeRIP-qPCR, RIP-qPCR |
| 动物实验 | 他莫昔芬给药方案、药物剂量、给药方式、小鼠品系和数量 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |