CESC的分离和鉴定
获取并验证具有干细胞特性的兔软骨终板干细胞。
从兔胸腰椎分离软骨终板，经胶原酶消化获得细胞，通过低熔点琼脂糖筛选和克隆化获得CESCs，并通过流式细胞术检测CD90、CD105、CD34表达，以及多向分化诱导验证其分化能力。
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MAPKs/mTOR通路在张力负荷诱导软骨终板干细胞退变过程中的机制研究
Mechanism of the Mitogen-Activated Protein Kinases/Mammalian Target of Rapamycin Pathway in the Process of Cartilage Endplate Stem Cell Degeneration Induced by Tension Load
实验完整度
中包含细胞模型建立、功能验证（MTT、凋亡检测）、分子机制验证（Western blot、siRNA敲低）及自噬检测，但缺乏体内实验。
主要模型
兔软骨终板干细胞（CESC） 张力负荷诱导的CESC退变模型
重点核对
张力负荷参数：10%伸长率、0.5 Hz、每天4小时、持续25天 mTOR通路抑制剂rapamycin浓度：100 nM JNK和ERK的siRNA敲低效率需通过RT-qPCR验证 自噬标记物：LC3-II、Beclin-1、p62蛋白水平 软骨标记物：ACAN、COL-2A、SOX9 mRNA表达
摘要
研究设计：基础研究。目的：椎间盘退变（IVDD）由软骨终板（CEP）引起。软骨终板干细胞（CESC）参与CEP退变的修复。张力负荷（TL）在IVDD的发生和发展中起重要作用。本研究旨在探讨张力负荷诱导CESC退变过程中MAPK/mTOR通路的调控机制。方法：从新西兰大耳白兔（6月龄）中分离CESCs。应用FX-4000T细胞应力加载系统建立TL诱导的CESC退变模型。Western blotting检测退变CESC中mTOR通路相关蛋白和自噬标记物LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的水平。通过细胞转染抑制退变CESC中MAPK通路相关蛋白JNK和细胞外信号调节激酶（ERK）的表达，以探讨JNK和ERK是否在TL诱导的CESC自噬中发挥调节作用。结果：在CESC退变模型中，mTOR通路被激活。抑制mTOR后，CESC的自噬水平升高，CESC的退变减轻。MAPK通路在CESC退变模型中也处于激活状态。抑制JNK表达可能通过抑制Raptor磷酸化和激活自噬来减轻TL诱导的CEP退变。抑制ERK表达可能通过抑制mTOR磷酸化和激活自噬来减轻TL诱导的CEP退变。结论：抑制MAPK信号家族中的JNK和ERK，通过抑制mTOR通路中Raptor和mTOR的磷酸化，减轻TL诱导的CESC退变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 张力负荷诱导的软骨终板干细胞退变过程中，MAPK/mTOR通路如何调控细胞自噬和退变？
- 核心机制
- 张力负荷激活MAPK通路，JNK通过磷酸化Raptor、ERK通过磷酸化mTOR，抑制自噬，促进CESC退变；抑制JNK或ERK可减轻退变。
- 主要证据
- 在兔CESC张力负荷模型中，Western blot显示p-JNK、p-ERK、p-mTOR、p-Raptor升高；siRNA敲低JNK或ERK降低相应磷酸化水平，增加自噬标志物LC3-II和Beclin-1，降低p62，并改善细胞活力和软骨标志物表达。
- 研究意义
- 为理解椎间盘退变的病理机制提供新见解，提示MAPK/mTOR通路可能成为预防和治疗IVDD的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立TL诱导的CESC退变模型
模拟张力负荷环境，建立CESC退变模型。
使用FX-4000T细胞应力加载系统对CESCs施加周期性张力（10% elongation, 0.5 Hz），每天4小时，持续25天。对照组不加载。通过MTT、Annexin V-FITC/PI染色和RT-qPCR检测细胞活力、凋亡和软骨标志物表达。
检测mTOR通路在退变CESC中的激活
验证TL诱导的退变CESC中mTOR通路是否被激活。
通过Western blot检测mTOR、p-mTOR、Raptor、p-Raptor蛋白水平，计算磷酸化比例。
抑制mTOR通路评估对退变的影响
探究抑制mTOR通路是否通过激活自噬减轻TL诱导的CESC退变。
在TL条件下加入rapamycin (100 nM)处理，检测细胞活力、凋亡、软骨标志物和自噬相关蛋白（LC3-II, Beclin-1, p62）的表达。
检测MAPK通路在退变CESC中的激活
验证MAPK通路在TL诱导的退变CESC中是否被激活。
通过Western blot检测ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38水平。
JNK敲低对CESC退变和自噬的影响
探究JNK是否通过磷酸化Raptor参与调节TL诱导的CESC退变和自噬。
在TL条件下，使用si-JNK转染CESCs，检测JNK mRNA水平、Raptor磷酸化、细胞活力、凋亡、软骨标志物和自噬蛋白。
ERK敲低对CESC退变和自噬的影响
探究ERK是否通过磷酸化mTOR参与调节TL诱导的CESC退变和自噬。
在TL条件下，使用si-ERK转染CESCs，检测ERK mRNA水平、mTOR磷酸化、细胞活力、凋亡、软骨标志物和自噬蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞分离与鉴定
建立退变模型
验证功能变化
基因敲低
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 琼脂糖 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞鉴定 | 抗CD90-FITC抗体 | Abcam | ab124527 |
| 抗CD105-FITC抗体 | Abcam | ab18278 | |
| 抗CD34-FITC抗体 | Abcam | ab131589 | |
| 细胞培养 | BioFlex 6孔板 | Flexcell International Corporation | -- |
| FX-4000T细胞应力加载系统 | Flexcell International Corporation | -- | |
| 细胞处理 | 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | 553211 |
| 细胞转染 | JNK-siRNA | Cell Signaling Technology | 6232 |
| ERK-siRNA | Cell Signaling Technology | 6560 | |
| SignalSilence®对照siRNA | Cell Signaling Technology | 6568 | |
| Lipofectamine™2000转染试剂盒 | Gibco | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 分光光度计（Bio-Rad 680） | Bio-Rad | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | YEASEN Biotech | -- |
| 流式细胞仪（MoFloAstrios EQ） | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Boster | -- | |
| 抗mTOR抗体 | Abcam | ab134903 | |
| 抗p-mTOR (Ser2448)抗体 | Cell Signaling Technology | 5536 | |
| 抗Raptor抗体 | Abcam | ab40768 | |
| 抗p-Raptor (Ser792)抗体 | Cell Signaling Technology | 8914 | |
| 抗ERK抗体 | Abcam | ab32537 | |
| 抗p-ERK (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗JNK抗体 | Abcam | ab110724 | |
| 抗p-JNK (Thr183/Tyr185)抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗p38抗体 | Abcam | ab170099 | |
| 抗p-p38 (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗LC3 II/I抗体 | Abcam | ab128025 | |
| 抗Beclin-1抗体 | Abcam | ab207612 | |
| 抗p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab205718 | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂盒 | R&D Systems Inc. | -- |
| 逆转录试剂盒 | Takara Bio Inc. | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| 引物 | Sangon Biotech | -- | |
| 数据分析 | SPSS 21 | IBM Corp. | -- |
| GraphPad Prism 8.01 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CESC分离与培养 | 动物品系、年龄、性别；组织来源（胸腰椎）；消化酶类型和浓度；培养基成分（FBS浓度、抗生素）；培养条件（温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Isolation, Extraction, and Culture of Rabbit CESCs |
| CESC鉴定 | 流式抗体及浓度；分化诱导培养基成分（地塞米松、β-甘油磷酸、TGFβ1等浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Flow Cytometry, Identification of Multidirectional Differentiation Ability of CESCs |
| 张力负荷模型 | 应力加载系统型号；拉伸参数（10% elongation, 0.5 Hz, 4小时/天, 25天）；细胞密度；培养板类型（BioFlex coated with type I collagen） 阅读提示：Materials and Methods: Establishment of CESCs Degeneration Models Induced by TL |
| 药物处理 | rapamycin浓度（100 nM）；处理时长（25天）；对照组（PBS）设置 阅读提示：Materials and Methods: Cell Treatment and Grouping |
| 基因敲低 | siRNA序列来源（JNK-siRNA #6232, ERK-siRNA #6560, Control #6568）；转染试剂（Lipofectamine2000）；转染效率验证（RT-qPCR） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Transfection |
| Western blot | 抗体稀释比、内参（GAPDH）、显影分析软件 阅读提示：Materials and Methods: Western Blot; Figures 2, 3, 4, 5 legends |
| 细胞活力与凋亡 | MTT实验细节（细胞密度、MTT浓度、溶解液、检测波长）；凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI） 阅读提示：Materials and Methods: MTT Assay, Annexin V-FITC/PI Double Staining |
| RT-qPCR | 引物序列（表1）；RNA提取试剂；逆转录试剂；PCR反应体系和条件 阅读提示：Materials and Methods: RT-qPCR; Table 1 |