技术专题 | CRISPRi干扰技术：基因调控新工具【收藏】

一、概述

CRISPR-Cas9技术自2012年首次被发现以来，迅速成为基因编辑领域的重要工具。随着该技术的发展，科学家们逐渐在此基础上发展出两种重要的调控工具——CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）。这两种技术并不直接编辑DNA序列，而是通过特定的分子机制调节基因的表达水平，从而在基因调控研究、疾病治疗及生物工程等领域展现出巨大的潜力。本技术专题将重点对CRISPRi技术进行详细介绍

二、CRISPRi（CRISPR干扰）

2.1 工作原理

CRISPRi是基于CRISPR-Cas9系统的一种基因抑制技术^[1]，利用一种“催化失活”的Cas9蛋白（dCas9）来实现基因抑制。dCas9蛋白在目标DNA上结合并定位到特定的基因区域，但不再进行剪切。通过将转录抑制因子（如KRAB域）与dCas9融合，可以有效地抑制目标基因的转录，从而降低基因的表达水平。CRISPRi的关键特征是通过这种方式“关闭”特定基因，而不改变其DNA序列。

图1 CRISPRi原理简图

2.2 常用的转录抑制因子

2.2.1 KRAB（Krüppel-associated box）

• 简介：KRAB是最常用的转录抑制子之一。它来源于Krüppel样转录因子家族（Krüppel-like family），并且已被广泛应用于CRISPRi系统中^[2]。

• 工作原理：KRAB通过与转录因子共抑制蛋白（如KAP1）结合，招募表观遗传学修饰酶（如组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2和组蛋白甲基转移酶），抑制目标基因的转录。这些酶通过去乙酰化或甲基化组蛋白，降低染色质的开放性，从而减少转录活性。

2.2.2 SID (SRF Interacting Domain)

• 简介：SID是另一种常见的转录抑制子，最初来源于SRF（Serum Response Factor）与其抑制因子之间的相互作用域。

• 工作原理：SID可以通过与dCas9融合并招募特定的抑制因子来实现转录抑制。虽然SID本身的抑制效果通常不如KRAB强，但它仍然是一个有用的选项，特别是用于某些特定的实验系统中。

2.2.3 SALL1-SDS3

• 简介：SALL1是一种转录抑制因子，能够招募SDS3并与HDAC复合体结合；SDS3是Sin3-HDAC复合物的核心部分，促进组蛋白去乙酰化（HDAC活性），导致染色质紧缩，使基因沉默。

• 工作原理：sgRNA引导dCas9-SALL1-SDS3 结合目标基因启动子区域，SALL1 通过C端的EAR结构域结合 SDS3，进一步招募 HDAC1/2（组蛋白去乙酰化酶），去乙酰化H3K9ac、H3K27ac（组蛋白去乙酰化），使染色质紧缩，RNA聚合酶 II 结合减少，基因表达被沉默^[3]。

2.3 CRISPRi与RNAi技术的比较

图2 RNAi、TALEN以及CRISPRi的比较^[4]

2.4 应用场景

2.4.1 基因功能研究

CRISPRi可以用于研究基因在不同生理和病理条件下的功能。通过抑制特定基因的表达，研究人员可以评估这些基因在细胞生长、分化、发育等过程中的作用。

CRISPRi扩展了CRISPR基因编辑技术的应用范围，为功能基因筛选提供了新的工具，本研究通过CRISPRi筛选^[5]，发现了MALT1、BCL10等基因促进T细胞表达细胞因子，这些因子在T细胞的刺激响应和功能调节中发挥重要作用。这些发现为深入理解T细胞的功能机制提供了新的视角，并可能为未来免疫治疗的设计和优化提供参考。

2.4.2 疾病研究

通过使用CRISPRi技术，研究人源能够精确调控病理相关基因的表达，构建各种疾病模型，尤其是在癌症、神经退行性疾病和遗传性疾病的研究中具有重要意义。

该研究探讨了CRISPRi技术在原代神经元中高效抑制基因表达的应用^[6],研究者利用失活的Cas9（dCas9）融合KRAB抑制域，通过sgRNA靶向基因启动子区域，实现了稳定且特异的基因沉默。实验结果表明，CRISPRi在神经元中具有较高的靶向性和较低的脱靶效应，相较于RNAi等传统方法，提供了更长效、更精准的基因调控手段。该研究为神经科学研究提供了一种强有力的工具，有助于解析神经系统基因功能，并为神经疾病模型构建及潜在治疗策略开发奠定基础。

2.4.3 CRISPRi在iPS细胞中的研究

研究团队利用CRISPRi在iPS细胞中关闭了与COPD相关的基因（如DSP）^[7]，发现这些基因在肺泡上皮细胞中的功能缺陷与疾病发生密切相关。这项研究为COPD的遗传机制提供了新的见解。

三、参考文献

【1】Larson MH, et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96.

【2】Almeida RS, et al. CRISPR/Cas9 Genome-Editing Technology and Potential Clinical Application in Gastric Cancer. Genes (Basel). 2022 Nov 4;13(11):2029.

【3】Mills C, et al. A Novel CRISPR Interference Effector Enabling Functional Gene Characterization with Synthetic Guide RNAs. CRISPR J. 2022 Dec;5(6):769-786.

【4】Boettcher M, et al. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 2015 May 21;58(4):575-85.

【5】Schmidt R, et al.CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells. Science. 2022 Feb 4;375(6580):eabj4008.

【6】Zheng Y, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):447-454.

【7】Werder RB, et al. CRISPR interference interrogation of COPD GWAS genes reveals the functional significance of desmoplakin in iPSC-derived alveolar epithelial cells. Sci Adv. 2022 Jul 15;8(28):eabo6566.

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