一叶知秋 | SH-SY5Y细胞基因编辑全攻略，助你高效解锁疾病机制，突破神经科学瓶颈！

1. 细胞背景

SH-SY5Y细胞系是神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH（ATCC HTB-11）的三次克隆亚系，于1970年从一名4岁癌症患者的转移性骨肿瘤样本中建立。作为神经退行性疾病研究的“明星细胞”，SH-SY5Y细胞凭借其可增殖性和类神经元特性，成为探索阿尔茨海默病、帕金森病等机制的关键工具。然而，这类细胞的敏感性和基因编辑难度常让科研人头疼。本文从培养技巧到基因编辑策略，为你梳理一套高效实验方案。

2. 细胞描述

物种：人 

组织：骨，骨髓

细胞形态：贴壁细胞，上皮细胞状

细胞倍增时间：~48-72 hours

疾病：成神经细胞瘤

应用：3D细胞培养，高通量筛选，免疫学，神经科学，毒理学

培养条件  

完全培养基成分：EMEM/F12+10% FBS+1%P/S

培养环境：37℃、5%CO2

传代比例：1：2~1：3

传代频次：5~6 天传代一次

细胞形态图片

图1 SH-SY5Y细胞ATCC参考正常形态图

3. 常见问题

3.1 细胞皱缩

SH-SY5Y细胞贴壁不是很紧密，当运输过程中收到震荡或温度及二氧化碳变化时，会出现皱缩甚至脱落的现象。对于运输过程导致的细胞皱缩脱落，可以将细胞静置恢复4-6小时，然后取脱落的细胞离心后重新用新的培养基铺板。

另外，细胞密度过高时，会聚团皱缩。当出现这种情况时，细胞已经老化，对于后续的实验会有一些风险，可能会导致转染失败或单克隆铺板失败。所以，在培养SH-SY5Y细胞时需要勤换液，勤观察，切勿让细胞过度生长，建议做实验的细胞密度控制在70%左右。 

日常培养时要注意操作细节，可以减少对细胞的损伤，确保细胞状态优良，适于功能研究等实验。可以从以下方面来优化实验体系：如果细胞密度超过80%，就必须要传代，传代时切勿暴力吹打，避免对细胞造成机械损伤。使用质量好的培养基和胎牛血清，减少内毒素等有害物质对细胞的刺激。请勿频繁把细胞从培养箱拿出，气温低时需开暖气维持细胞房温度；使用PBS、培养基前37度预热，以避免温差对细胞造成刺激。

图2 SH-SY5Y细胞聚团皱缩图片

3.2 细胞聚团

SH-SY5Y细胞非常敏感，在受到温度、化学或物理刺激后容易出现成团现象。一个视野下，有少量成团现象，无需特殊处理。成团严重，几乎没有铺展开的细胞并且培养数天未展开时，就需要特殊处理一下了。

图3 SH-SY5Y细胞成团严重图片

聚团严重时如何处理？

• 细胞密度：低密度接种，用胰蛋白酶消化细胞（不超过5min），按1：6比例传代接种，并换新的培养器皿。延长换液时间，3天换液一次，防止细胞脱落。
• 预处理培养皿：使用多聚赖氨酸包被的培养器皿，以加快细胞贴壁速度，降低细胞聚集成团的几率。
• 加大血清比例：更换新配制的培养基，并加大血清比例（不超过20%）。
• 减少培养体积：接种时，减少培养基量（如T25加3mL）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基。

3.3 漂浮细胞多

ATCC官网中，SH-SY5Y存在两种形态，贴壁细胞或半贴壁半悬浮细胞，在悬浮状态下SH-SY5Y细胞也能维持生长。当培养瓶中大部分为贴壁细胞，少量为悬浮细胞可不用特殊处理。可以将悬浮细胞取出一部分进行活细胞计数，如果活力高则不用特殊处理。如果出现大量悬浮的细胞，就需要引起注意了。针对大量细胞漂浮的情况，推荐处理方法：将悬浮细胞离心收集，用新鲜培养基重悬后接种回原瓶。当贴壁细胞生长状态良好、密度适中时，可以舍弃悬浮细胞。

图4 SH-SY5Y细胞半贴壁半悬浮状态图

3.4 细胞碎片多

细胞碎片我们观察时可以分成两种情况：细胞内的黑色小点及细胞外的黑色杂质。

（1）细胞内的小黑点是细胞分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加。出现这种情况无法清除也无法改变，但是需要密切注意，排除支原体或黑胶虫污染导致。

（2）细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，我们从ATCC官方图片上也可以看到，当细胞密度低时，很容易看到一些小碎片。当出现大量小碎片时，证明细胞状态需要调整。如果此时细胞密度低，我们可以对其进行换液处理，提高血清比例至15%~20%。如果细胞达到可以传代的密度了，我们可以对其进行消化，并用PBS多洗几遍，去除细胞碎片后重新铺板至新的培养皿中。

4. SH-SY5Y细胞基因敲除示例

CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如293、A549、HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）ko pool敲除效率大部分能达到80%以上。

而SH-SY5Y细胞由于倍增时间超过48h，导致编辑难度增加。针对这种情况粒曼生物优化了sgRNA设计方案，并通过大量实验优化了细胞转染条件，在粒曼团队SH-SY5Y细胞的ko pool敲除效率也能达到80%以上。

 

SH-SY5Y细胞基因敲除示例：