技术专题 | 蛋白邻近标记（PL）：蛋白互作研究的新标配【收藏】

蛋白质在生物体中的功能往往依赖于其与其他分子的相互作用，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子等。传统的蛋白质相互作用检测方法，如免疫共沉淀(Co-IP)、GST Pull-Down等，虽然为研究这些相互作用提供了有效的工具，但它们通常存在空间分辨率低、条件苛刻、破坏细胞器的完整性等局限性。蛋白邻近标记（proximity labeling, PL）技术近年来逐渐成为一种高效、特异性强、且具有高时空分辨率的蛋白质相互作用研究工具。

 

 

图1 常用PL酶的标记原理示意图（Mathew et al., 2022）

 

一、蛋白临近标记的原理

蛋白邻近标记技术的基本原理是通过将某种酶（如过氧化物酶或生物素化酶）与目标蛋白融合表达，当目标蛋白与其他蛋白质靠近时，酶会触发化学反应，将活性标记分子（如生物素或荧光分子）连接到其附近的蛋白质上。这些标记蛋白随后可以通过亲和纯化等方法进行捕获和鉴定，从而揭示目标蛋白的相互作用网络。

二、常用的酶系统

1、BioID（生物素化标记法）

BioID技术使用生物素蛋白连接酶BirA的突变体BirA*，该突变体能够在低浓度生物素条件下，将生物素随机连接到靠近它的蛋白上（约10nm范围内）。这些生物素化的蛋白质随后可以通过链霉亲和素的纯化技术加以富集，并通过质谱分析鉴定。

2、APEX（过氧化物酶标记法）

APEX（增强型非天然过氧化物酶）是另一种广泛使用的邻近标记系统。APEX酶能够催化过氧化氢将生物素酚衍生物氧化为反应性自由基，这些自由基迅速与邻近的蛋白质反应形成共价键。APEX的标记范围在1-2nm以内，标记效率高，且能够在活细胞和固定细胞中应用。

 

图2 BioID和APEX对比

3、TurboID和miniTurbo

TurboID是BioID的升级版本，反应时间更短（10分钟内完成标记），适用于活细胞的快速标记。MiniTurbo是TurboID的一个小型化版本，在较小的空间需求下也具有高效的标记性能，适合特定的实验设计。

三、蛋白邻近标记的应用

1、蛋白质相互作用网络解析

通过邻近标记技术，可以在活细胞中原位捕捉目标蛋白与其交互蛋白的“邻居”，从而绘制其相互作用网络。这种方法不仅可以识别稳定的复合物，还可以检测短暂或弱相互作用。

研究人员通过结合APEX2的邻近标记、定量质谱在时间维度上分析了EGFR的邻近蛋白质组的动力学。使用这种方法解释了一个涉及信号转导过程的蛋白质网络。为发现受体酪氨酸激酶的信号转导和细胞内运输的新调节机制开辟了道路。

 

2、亚细胞定位与动态变化研究

蛋白邻近标记能够在特定的细胞器或细胞区室中进行，帮助研究蛋白质在特定亚细胞结构中的分布。特别是APEX的高时空分辨率可以用于实时监测蛋白质在细胞中的动态变化。

研究人员利用APEX2邻近标记铜伴侣蛋白Atox1，随后利用该蛋白的核定位和铜传输功能，将其用作“诱饵”，从而提供了活细胞内具有时空分辨率的铜蛋白互作网络系统视图。通过二甲基标记定量蛋白质组学分析，确定了CRIP2可以作为潜在的铜结合蛋白与Atox1相互作用，为肿瘤内铜紊乱的治疗提供新的作用机制和药物筛选靶点。

 

3、特定蛋白质复合物的鉴定

在某些生物学过程中，蛋白质的功能往往依赖于其形成的复合物。邻近标记技术能够捕捉这些复合物，并通过质谱进行鉴定，为理解复杂的信号通路或调控机制提供线索。

在下面这项研究中，TurboID 被用于研究人类 T 细胞中的 Lck 激酶复合物，Lck 在 T 细胞受体信号传导中起着至关重要的作用。研究人员通过 TurboID 捕获了 T 细胞激活时与 Lck 交互的蛋白质，揭示了免疫应答中信号复合物的关键组成部分。

 

4、药物靶标发现

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞内主要的蛋白质降解系统之一，泛素连接酶突变导致的异常调节与很多疾病相关。而E3泛素连接酶底物的鉴定由于其低亲和、相互作用短暂、靶标易降解等一直具有挑战性，特别是在蛋白降解药物（TPD）研究领域，E3泛素连接酶的互作蛋白鉴定成为了大家越来越关注的领域。

粒曼针对“蛋白临近标记”的相关产品及服务：

1. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：基因原位N端/C端插入birID,TurboID等标签用于临近标记检测，可发现蛋白-蛋白互作（弱互作、瞬时互作）；原位插入Strep-tag等用于AP-MS检测，可发现强蛋白-蛋白相互作用；

2. 粒曼strep II纯化填料：针对Strep-tag蛋白以及生物素标记的蛋白（例如临近标记后获得的）进行极高亲和力富集（比抗体富集的亲和力高100倍）；

3. AP-MS/IP-MS检测：针对临近标记或者亲和标记（Strep-tag）的细胞样本进行质谱检测，发现互作蛋白；

4. 人/鼠源基因敲除阵列arrayed文库筛选：针对19+代谢通路（含300+ E3泛素连接酶KO阵列库，1000+ 泛素相关酶KO阵列库），更高精确性、数据解读简化、实验重复性强、研究需求更广。

 

四、常见蛋白互作技术对比

 

Co-IP 适合验证已知的稳定蛋白复合物，但对瞬时相互作用和弱相互作用较不敏感。

 

图3 Co-IP基本实验流程

GST pull-down 适用于分析体外蛋白互作，尤其是检测已知的直接相互作用，但不适合研究复杂的、动态的相互作用。

 

图4 GST pull-down基本实验流程

PL（proximity labeling） 在体内进行，适合捕捉动态、瞬时的蛋白互作，特别是亚细胞区室或膜蛋白的相互作用。

 

图5 PL（proximity labeling）基本实验流程

五、参考文献

 [1] Mathew B, Bathla S, Williams KR, Nairn AC. Deciphering Spatial Protein-Protein Interactions in Brain Using Proximity Labeling. Mol Cell Proteomics. 2022 Nov;21(11):100422. doi: 10.1016/j.mcpro.2022.100422. 
[2] Perez Verdaguer M, et al.Time-resolved proximity labeling of protein networks associated with ligand-activated EGFR. Cell Rep. 2022 Jun 14;39(11):110950.

[3] Chen L, et al.APEX2-based Proximity Labeling of Atox1 Identifies CRIP2 as a Nuclear Copper-binding Protein that Regulates Autophagy Activation. Angew Chem Int Ed Engl. 2021 Nov 22;60(48):25346-25355.

[4] Chua XY,et al.Quantitative Interactomics of Lck-TurboID in Living Human T Cells Unveils T Cell Receptor Stimulation-Induced Proximal Lck Interactors. J Proteome Res. 2021 Jan 1;20(1):715-726.