基因编辑研究聚焦PKM1、PBRM1和S100A9基因敲除

  因敲除细胞是指利用CRISPR技术进行基因编辑，通过设计特定的sgRNA靶向目标基因的剪切位点，使Cas9蛋白与sgRNA结合并将目的基因从细胞中“剪切”掉，从而实现基因敲除。基因敲除细胞在生命科学、医学和药物研发等领域都有着广泛的应用前景，如利用基因敲除技术建立疾病模型、进行药物筛选和靶点验证、敲除致病基因实现对疾病的基因治疗等。本文选取三篇基因敲除细胞的相关研究为大家进行解读，带您了解这一前沿技术的新进展。

 

一、CRISPR/Cas9系统成功敲除PKM1基因，优化CHO细胞系的乳酸生成行为
  中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是生物制药行业最常用的哺乳动物细胞系之一，用于生产各种治疗性蛋白质，如抗体、激素和其他重组蛋白。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase Muscle，PKM）是一种负责在糖酵解过程中将PEP转变为丙酮酸的酶，丙酮酸可用于细胞能量产生或转化成乳酸。在CHO细胞中，PKM1的表达水平与乳酸生成行为直接相关。研究人员通过CRISPR/Cas9的技术手段敲除PKM1基因可以消除乳酸积累。
  在这项研究中，研究人员使用CRISPR/Cas9技术敲除PKM1基因，探究PKM1在CHO细胞系乳酸生成行为中的作用，并验证PKM1水平与乳酸生成之间的直接相关性。结果显示，在敲除了PKM1的细胞系中，没有观察到乳酸积累，即使在利于乳酸积累的培养条件下，乳酸积累也得到了消除，结果表明PKM1的活性是乳酸生成所必需的。通过CRISPR/Cas9系统敲除PKM1基因的细胞系保持了与野生型细胞系相似的生产力和细胞活力，表明PKM1的缺失不会对细胞的生存或生产能力产生负面影响。在工业生产中CHO细胞如果表现出高水平的乳酸生成行为，可能会导致细胞活力和生产力下降，影响生产过程的效率和产品质量。乳酸积累还会引起培养基pH下降，需要添加碱性物质来调节pH，这可能会导致渗透压的增加，进一步影响细胞的生长和蛋白质的生产。通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术敲除或抑制PKM1的表达有助于或消除或减少CHO细胞培养过程的乳酸生成，从而提高生产效率和产品质量。

图1 消除或减少PKM 1表达可避免mAb-2细胞系中的乳酸生成行为

 

二、PBRM1基因敲除与ccRCC中较低的免疫原性TME相关
  肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是全球十大常见恶性肿瘤之一，最常见的组织学亚型为透明细胞肾细胞癌（clear cell RCC，ccRCC）。ccRCC中存在重要的继发性基因突变，包括PBRM1（polybromo-1）基因。PBRM1是开关/蔗糖非发酵(SWI/SNF)染色质重塑复合体的一部分，约40%的ccRCC存在PBRM1突变。到目前为止，关于PBRM1缺失对免疫反应的影响的数据是不一致的，因此研究人员对于ccRCC中PBRM1缺失对肿瘤微环境（TME）的影响进行了研究。

  研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了Pbrm1基因，构建了Pbrm1敲除的Renca小鼠RCC细胞系及其衍生的肿瘤，并采用了Renca-Balb/c免疫小鼠模型进行研究。他们通过免疫组织化学（IHC）染色方法对不同小鼠肿瘤中的免疫标记物进行了评估，包括CD3、CD8、CD4、PD-1和P-STAT1。研究发现，在对照组小鼠的肿瘤中，CD3、CD4、CD8 T细胞和p-STAT1阳性细胞的水平明显高于Pbrm1基因敲除小鼠的肿瘤，同时免疫检查点蛋白PD-1在对照组肿瘤中的表达水平也更高。CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了Pbrm1基因的细胞系构建肿瘤模型证明Pbrm1缺陷与较低的免疫原性肿瘤微环境有关，对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。

图2 Pbrm1敲除肿瘤与低免疫原性TME相关

 

三、S100A9的敲除为SICM的致病机制的研究提供更进一步探索
  败血症性心肌病（Sepsis-induced cardiomyopathy，SICM）是一种常见的由败血症引起的心功能障碍，SICM的病理机制非常复杂，包括几个关键因素，如心肌抑制、线粒体功能障碍、炎症反应和氧化应激。S100钙结合蛋白A9（S100A9）是一种钙和锌结合蛋白，在炎症和免疫反应中发挥着关键的调节作用，但目前对S100A9诱导败血性心力衰竭和心肌损伤的确切机制了解有限。

  利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究人员敲除了小鼠的S100a9基因，并使原代心肌细胞暴露于脂多糖中，模拟了SICM。通过监测炎症标志物和S100A8/9的表达，他们成功地模拟了败血症诱导的心肌病。胸部超声心动图的检查显示，与野生型小鼠相比，S100a9基因敲除小鼠在败血症诱导的心肌病中显示出心肌损伤的缓解。透射电子显微镜的分析显示，野生型对照组的心肌细胞中线粒体嵴密度均匀，而在野生型败血症组中，线粒体的数量和大小异质性显著增加。敲除S100a9基因后，线粒体的损伤有所减轻，并恢复了正常的结构。这些发现揭示了S100A9在败血症诱导的心脏损伤和功能障碍中的作用，并阐明了其诱导氧化应激和线粒体功能障碍的潜在机制。利用CRISPR-Cas9技术敲除S100A9基因的细胞来研究该基因与SCIM间的关联性，提供一种SCIM可能的治疗方案，对SCIM致病机理的研究做出贡献。

图3 敲除S100a9基因减轻了线粒体损伤和氧化应激