细胞传代方法

细胞传代方法

1．将完全培养基、PBS、胰酶预热至 37℃；
2．从培养容器中吸弃上清；
3．从容器一侧轻轻加入冲洗液 PBS（T25 培养瓶加入约 6mL）洗涤细胞 1 次。注意动作轻柔，清洗全面，避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次吸去 PBS（注：冲洗步骤可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁）；
4．加入胰酶（T25 培养瓶加入约 3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。放入培养箱消化；
5．显微镜下观察消化情况，约 70％～80％细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面；
6．立即加入 2 倍胰酶体积的完全培养基（T25 培养瓶加入约 6mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化；
7．使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。
8．将细胞悬液转移至离心管中。用 PBS（T25 培养瓶加入约 3mL）洗涤容器 1 次，收集残留细胞；
9．收集的所有细胞悬液以 1100rpm 离心 4min；
10．离心后去除上清。加入 1mL 完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀；
11．将细胞按一定的比例传代接种，建议首次按照 1：3 进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例；
注意：请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
12．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中（如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）；
13．传代次日，观察细胞状态。若发现较多死细胞，进行换液操作。之后，每根据细胞的生长情况更换完全培养基，观察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代或冻存。