上海西格生物科技有限公司
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PCR反应PCR设计引物详述
人阅读 发布时间：2023-12-20 14:51
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片段，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR只能复制很短的DNA片段，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。下面详述PCR设计引物：
一、PCR设计引物前应的准备工作：
1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分
2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用
3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用
二、引物的结构：
5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’
1．两个酶切位点
2．酶切位点的保护碱基
3．5’端保护碱基
4．3’端保护碱基
5．引物配对区
三、PCR引物设计原则：
引物设计有3 条基本原则：
首先引物与模板的序列要紧密互补；
其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计基本原则
1）、引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
2）、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
4）、扩增子Tm：>92℃；
5）、3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
6）、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
7）、末端2bp最好为GC；
8）、引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。
基于上述原则，在实践分两种情况中应用：
1、基因克隆PCR引物设计
这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配最优设计要求了。
2、鉴定PCR引物设计
我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。
四、设计引物所要考虑的问题
1．酶切位点
两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
2．酶的选择
最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。
3．Tm的计算
Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等参数。
4．退火温度
退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去， PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。
5．5’端保护碱基
一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基
6．引物二聚体
关于引物二聚体，最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的△G（自由能）的绝对值，如果小于10，一般是问题的。如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果 PCR没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。
7．引物的设计
在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是28bp左右了。而我们在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。
还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚。设计时限制性酶切位点是应该在5’端的顶端。在设计引物时，常在5’端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先用软件设计出合适的引物，引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A（容易错配）。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定，目的序列上并不存在的。
聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片段，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR只能复制很短的DNA片段，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。下面详述PCR设计引物：
一、PCR设计引物前应的准备工作：
1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分
2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用
3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用
二、引物的结构：
5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’
1．两个酶切位点
2．酶切位点的保护碱基
3．5’端保护碱基
4．3’端保护碱基
5．引物配对区
三、PCR引物设计原则：
引物设计有3 条基本原则：
首先引物与模板的序列要紧密互补；
其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计基本原则
1）、引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
2）、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
4）、扩增子Tm：>92℃；
5）、3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
6）、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
7）、末端2bp最好为GC；
8）、引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。
基于上述原则，在实践分两种情况中应用：
1、基因克隆PCR引物设计
这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配最优设计要求了。
2、鉴定PCR引物设计
我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。
四、设计引物所要考虑的问题
1．酶切位点
两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
2．酶的选择
最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。
3．Tm的计算
Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等参数。
4．退火温度
退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去， PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。
5．5’端保护碱基
一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基
6．引物二聚体
关于引物二聚体，最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的△G（自由能）的绝对值，如果小于10，一般是问题的。如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果 PCR没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。
7．引物的设计
在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是28bp左右了。而我们在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。
还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚。设计时限制性酶切位点是应该在5’端的顶端。在设计引物时，常在5’端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先用软件设计出合适的引物，引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A（容易错配）。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定，目的序列上并不存在的。
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